油棕体细胞胚的诱导和次生胚的增殖研究

邹积鑫　潘登浪　林位夫

摘 要 油棕体细胞胚的诱导是油棕体胚发生技术体系中最关键的培养过程，通过建立油棕次生胚增殖培养方法可有效地实现油棕组培苗快速的增殖繁育。本研究通过系统的对油棕体细胞胚发生及次生胚再生途径中若干影响因子的比较研究，建立油棕体细胞胚和次生胚再生体系。结果表明：油棕体细胞胚再生体系在不同基因型的油棕品种内诱导率存在较大差别，其中植物外源激素二氯苯氧乙酸（2，4-D）对油棕胚诱导效果较好；油棕次生胚增殖在不同基因型的油棕品种内差异不显著，木本植物培养基（WPM）在油棕次生胚增殖中培养效果最好。

关键词 油棕 ；体胚发生 ；胚状体 ；次生胚

中图分类号 S565.9 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.08.006

Abstract Induction of oil palm somatic embryogenesis is the most critical cultural process in oil palm tissue culture. Rapid proliferation of oil palm can be effectively realized through the establishment of oil palm secondary embryogenesis regeneration in tissue culture. Several factors that affecting induction of oil palm somatic embryos and regeneration of secondary embryogenesis were compared systematically to establish a secondary oil palm somatic embryo regeneration system. The results showed that there is great difference in induction rate of somatic embryogenesis between different oil palm genotypes， and the woody plant medium （WPM） is the best basic medium in proliferation of oil palm secondary embryos.

Keywords oil palm ； somatic embryogenesis ； embryo ； secondary embryogenesis

油棕是世界上重要的热带木本油料作物，通过组培可对获得的优良单株进行快速繁殖，从而大幅度缩短育种、育苗时间。次生胚发生途径是指由原始体胚细胞（originally formed somatic embryos）或者初生胚状体（primary somatic embryos）发育获得体细胞胚的植物再生途径，许多植物在通过体胚发生途径获得离体再生植株过程中，初生体细胞胚的萌发率非常低，远远低于次生胚状体的萌发率。因此通过建立高频的次生胚状体途径获得离体再生植株的研究在单子叶和双子叶植物组织培养技术研究中都有广泛的报道。李洪清等[1]以木薯成熟的胚状体子叶为外植体材料建立次生胚再生体系，每个外植体材料可获得32.5个次生胚状体。孙艳香等[2]以苜蓿无菌苗下胚轴为外植体材料建立次生胚再生体系，筛选获得2个具有较强次生胚发生能力的株系。Giridhar等[3]以咖啡的叶片和茎为外植体材料建立植株再生体系，通过MS培养基添加三十烷醇成功获得高频的咖啡的次生胚。油棕组织培养技术最早由法国科学家Rabechault等[4]于1976年研究获得成功，随后在东南亚地区、南美洲地区的多家研究机构和公司有成功的报道[5]。目前马来西亚、印度尼西亚、哥斯达黎加等国已经开始油棕组培苗的商业化生产[6]。在20世纪80年代中国已有开展油棕组织培养相关的研究。崔元芳等[7]以油棕胚为外植体材料获得愈伤组织并建立植株再生体系。龚峥等[8]以油棕叶片为外植体材料成功获得愈伤组织。邹积鑫等[9]以油棕叶片为外植体材料建立植株再生体系并获得完整植株。虽然目前国内相关的研究已经取得了较大进展，但尚未得到广泛的应用和系统的研究，特别是不同油棕单株的体胚发生效率不一致，影响植株再生频率较低。鉴于此，本研究以前期建立的油棕离体再生体系为基础，对油棕3个品系优株的胚状体诱导及次生胚的增殖开展研究，旨在筛选获得最佳的油棕体胚及次生胚的增殖方法。

1 材料与方法

1.1 材料

以油棕易碎胚性愈伤组织为材料。油棕母树来自农业部儋州油棕种质资源圃，品种为RYL2、RYL4、RYL6，材料来源是由油棕幼嫩的叶片培养获得，详细方法参照邹积鑫等[11]采用的愈伤组织诱导方法。愈伤组织诱导是将叶片接种到MS培养基（添加5 mg/L 2，4-D、10 mg/L TDZ和质量分数为3%的蔗糖）获得，再将愈伤组织接种到MS培养基（添加0.1～1.0 mg/L 2，4-D）中获得易碎胚性愈伤组织。所有的培养基均添加6 g/L的琼脂，并将pH调至5.8，121℃高压灭菌15 min。 易碎胚性愈伤组织在光照培养条件下培养，温度为（28±2）℃，每1个月继代1次。

1.2 方法

1.2.1 油棕初生胚状体的诱导

选择3种不同品系的油棕愈伤组织接种到油棕初生胚状体培养基中进行诱导培养，基本培养基为木本植物培养基（WPM），并附加4种不同种类的植物激素：二氯苯氧乙酸、毒莠定、麦草畏、萘乙酸，其浓度为1 mg/L，每个处理50个，重复3次。将接种好的培养物置于光培养室中培养，培养温度为（28±1）℃，光照强度为3 000 lx，光照时间为12 h/d，每2个月继代培养1次，统计培养1～4个月的出胚情况，每月统计1次。

1.2.2 油棕次生胚状体的诱导及增殖

将培养2～4个月后的油棕初生胚状体切分成8～12 mm小块，接种到培养基中进行次生胚状体的诱导和增殖。基本培养基为MS、WPM、Y3培养基（附加2，4-D 0.1 mg/L和200 mg/L椰子水），每处理重复3次，培养温度为（28±1）℃，光照强度为3 000 lx，光照时间为12 h/d，每2个月继代培养1次，每月统计次生胚状体的生长情况。

2 结果与分析

2.1 不同培养因素对油棕胚状体诱导的影响

愈伤组织接种至初生胚状体诱导培养基后，培养1个月开始观察到愈伤组织逐渐膨大（图1-A），分化成心形胚组织，接着心形胚组织继续分化，顶部不断变尖成鱼雷型胚组织，最终形成芽的前体组织（图1-B）。品种、植物激素种类以及培养时间的多元方差分析和多重比较结果见表1、2。3个因素对油棕胚状体诱导的影响效果为：植物激素种类>品种>培养时间，其中4种植物激素的种类对油棕胚诱导率的影响达显著差异，不同油棕品种胚状体培养4个月后平均诱导率为2.5%～11.83%。RYL02材料中，植物激素对胚状体诱导率效果为：二氯苯氧乙酸>毒莠定>麦草畏>萘乙酸。RYL04材料中，植物激素对胚状体诱导率效果为：毒莠定>二氯苯氧乙酸>麦草畏>萘乙酸。RYL06材料中，获得的平均出胚率最高达11.83%，植物激素对胚状体诱导率效果为：二氯苯氧乙酸>毒莠定>麦草畏>萘乙酸。3个不同品种对油棕胚诱导率的影响达显著差异，其中RYL2品种与RYL4品种间无显著差异。油棕胚的出胚率随时间的增加而增加，但不同时间培养对油棕胚诱导率无显著差异。

2.2 不同培养因素对油棕次生胚诱导的影响

初生胚接种到次生胚培养基后，在胚状体表面开始形成小的突起，突起不断的生长变大，形成白色次生胚状体，次生胚状体继续分化形成鱼雷型胚，然后逐渐形成芽的前体（图1-C、1-D）。培养2个月后不同处理产生的次生胚个数为14.0～31.6个，RYL02在M3培养基中获得的次生胚数最高为31.6个，RYL04在M3培养基中获得的次生胚数最高为29.6个，RYL06在M2培养基中获得的次生胚数最高为31.6个。对品种、培养基类型、培养时间的多元方差分析和多重比较分析结果见表3、4。在诱导次生胚的培养过程中，培养基的种类对次生胚诱导的影响达显著差异，而品种类型对次生胚诱导的影响差异不显著，次生胚的数量随着时间的增加而不断增加，3种处理对次生胚诱导数量的影响大小为：培养基>培养时间>品种。

3 讨论与结论

通过体胚发生途径建立油棕组织培养技术体系，其初生胚的诱导比较困难，且诱导率也比较低，因此胚的诱导是整个油棕组织培养过程中最关键的技术环节，这一现象在其他的棕榈科植物，如椰子、海枣、槟榔等同样发生[10-12]。植物外源激素对油棕胚的诱导影响作用很大，二氯苯氧乙酸即2，4-D在油棕胚的诱导中，作用效果明显。近年来，关于油棕组织培养技术的报道中，2，4-D、毒莠定、麦草畏等植物外源激素都有使用，但2，4-D的使用更加广谱。本实验结果表明，2，4-D在初生胚诱导的过程中通用性较好，在3种不同基因型的油棕品系中，胚诱导率圴达到了比较高的水平。但在后续芽诱导的培养实验中，笔者发现，使用毒莠定的出芽率及芽发育的质量效果会更好。

次生胚诱导和增殖途径是油棕实现体胚增殖很有效的一种途径，可以弥补前期油棕初生胚诱导率较低的缺点，实现油棕组培苗数量上的大规模繁育。从本实验的结果看，在油棕次生胚培养阶段，不同基因型即不同油棕品种差异的影响不显著，如果在前期能够培养获得油棕初生胚，后期的次生胚培养可通过比较一致的方法进行增殖培养。同时，基本培养基的组成成分对油棕次生胚的诱导和再生具有显著的影响。本实验所选择的3种基本培养基中，MS是通用性较强的培养基[13]；WPM是针对木本植物培养的基本培养基[14]；Y3培养基的成分比较复杂，常用于椰子等棕榈植物的组织培养[15]。从诱导效果来看，WPM培养基和Y3培养基的作用明显优于MS培养基，这表明在无机盐相对较低的环境下可能比较利于次生胚的诱导；而WPM和Y3培养基比较，前者的组分相对后者简单，更利于大规模的商业化生产。

参考文献

[1] 李洪清，梁承邺，黄毓文，等. 影响木薯次生胚状体发生及植株再生因素的研究[J]. 广西植物，1999，19（3）：246-250.

[2] 孙艳香，杨红梅，尹 军，等. 紫花苜蓿高频体细胞胚与次生胚再生体系的建立[J]. 南开大学学报：自然科学版，2007，53（4）：1-6

[3] Giridhar P，Indu E P，Ravishankar G A，et al. Influence of triacontanol on somatic embryogenesis in Coffea arabica L. and Coffea canephora P. ex. Fr[J]. In Vitro Cellular Developing Biological Plant， 2004， 40（1）： 200-203.

[4] Rabechault H，Ahee J，Guenin G. Recherches sur la culture in vitro des embryos de palmier a huile （Elaeis guineensis Jacq.）. XII. Effects de substances de croissance a des doses supraoptimales. Relation avec le brunissement des tissues[J]. Oleagineux， 1976， 31（1）： 159-163.

[5] Zamzuri I， Mohd A S， Rajanaidu N， et al. Commercial feasibility of clonal oil palm planting material production[R]. PORIM Occasional Paper， 1999（40）： 52.

[6] Corley R H V， Tinker P B H. The oil palm[M]. Hoboken： John Wiley & Sons Ltd， 2008.

[7] 崔元方，龚 峥， 陈幸华，等. 油棕胚愈伤组织诱导及植株再生的研究[J]. Journal of Integrative Plant Biology，1986，28（6）：582-588.

[8] 龚 峥，崔元方，陈幸华，等. 油棕叶片愈伤组织的诱导[J]. 热带作物研究，1987，7（3）：15-18.

[9] 邹积鑫，尤丽莉，林位夫. 影响油棕叶片愈伤组织诱导因素研究[J]. 热带农业科学，2014，34（2）：54-58.

[10] Karunaratne S，Periyapperuma K. Culture of immature embryos of coconut， Cocos nucifera L： callus proliferation and somatic embryogenesis[J]. Plant Science， 1989， 62（2）： 247-253.

[11] Eshraghi P，Zarghami R，Mirabdulbaghi M. Somatic embryogenesis in two Iranian date palm cultivars[J]. African Journal of Biotechnology， 2005， 4（11）：1 309-1 312.

[12] Radha E， Karun A， Ananda K S， et al. Plantlet regeneration via direct and indirect somatic embryogenesis from inflorescence explants of arecanut palms（Areca catechu L.）[J]. Journal of Plantation Crops，2006， 34（3）： 540.

[13] Murashige T，Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures[J]. Physiol Plant， 1962， 15（3）： 473-497.

[14] Lloyd G， McCown B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel， Kalmia latifolia， by use of shoot tip culture[J]. Int Plant Prop Soc Proc， 1981， 30（3）： 421-427.

[15] Eeuwens， C J. Mineral requirements for growth and callus initiation of tissue explants excised from mature coconut palms（Cocos nucifera）and cultured in vitro[J]. Physiologia Plantarum， 1976， 36（1）： 23-28.