人参发状根低聚糖对小鼠肝脏生理活性指标的影响

王超　秦晶晶　韩怡来　王康宇　孙春玉　张美萍　王义

摘 要：研究人参发状根低聚糖对小白鼠肝脂，抗氧化等生理活性指标的影响。把低聚糖分成5个不同分子量的组分，各个组分分别配制5个不同饲喂浓度，阳性药组，阴性组，总苷组，共计28组，饲喂周期10d，摘取肝脏，然后对肝脏提取液进行测定各项生理指标。发状根低聚糖能显著降低胆固醇和甘油三酯含量，显著升高肝脏中谷胱甘肽含量，提高过氧化氢酶酶活性。25个低聚糖组分中B2在5mg/kg/d水平组和C在5mg/kg/d水平组具有降肝脂，提高抗氧化能力等生理活性。

关键词：低聚糖；胆固醇；甘油三酯；过氧化氢酶；谷胱甘肽

中图分类号：S567.51 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20160532001

人参 （PanaxginsengC.A.Mey.）为五加科人参属植物，名贵的保健品，以其根和根茎入药，味甘、微苦，微温，归脾、肝、心、肾经，具有大补元气、复脉固脱、补肝益脾、生津养血、安神益智等功效[1]。人参的化学组成非常复杂，主要含有皂苷类、多肽类和糖类等多种活性成分，糖类又可分为单糖、多糖和低聚糖[2]。人参发状根是经发根农杆菌A4菌株浸染人参外植体遗传转化而成，属非天然植物[3]。

研究发现，低聚糖具有多种生物活性，在临床上有广泛的使用价值。低聚糖的保健功能是目前保健食品功能因子中研究的热点之一，包括调节免疫力、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、降血脂降血糖等活性[5]。杨艳燕等[6]人研究发现魔芋低聚糖能降低小鼠血糖含量和提高抗氧化能力的影响。国内今年来亦有文献报道，毛新民等[7]研究发现大豆低聚糖降脂和提高抗氧化能力功能的研究。本课题对已提取分离纯化后人参发状根低聚糖进行活性低聚糖组分鉴定，探讨发状根低聚糖对小鼠肝脂，抗氧化能力等生理活性指标的影响，为研制具有保健性功能食品提供一定的理论根据。

1 材料与方法

1.1 材料，试剂，仪器

人参发状根低聚糖5个组分A、B1、B2、C、D：人参基因资源开发与用工程研究中心提供；雄性BALB/C小白鼠，体重20±1g，购于吉林大学。

胆固醇标准品，甘油三酯标准品，过氧化氢酶标准品，还原性谷胱甘肽标准品，胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶，过氧化氢酶，4-AAP，苯酚，甘油激酶，脂蛋白酯酶，甘油磷酸氧化酶，ATP，钼酸铵：长春百金生物科技有限公司；30%双氧水，异丙醇，氯仿，甲醇均为国产分析纯。

755紫外分光光度计：人参基因资源开发与用工程研究中心。

1.2 方法

1.2.1 小白鼠分组与饲喂方案

根据《中药药理研究方法学》关于人与小鼠体表面积换算的饲喂量公式[8]可知：

小鼠给药量=人的给药量×成人平均体重×0.0026×50

阳性对照组ginseng complex plus royal jelly给药量为38mg/d，经上述公式和单位换算公式折算出小鼠给药量为6.916～7mg/kg/d。以此为依据，设计给药量梯度为9 mg/kg/d、7 mg/kg/d、5 mg/kg/d、3 mg/kg/d、1 mg/kg/d，阳性药对照组及发状根总苷组给药量均为7 mg/kg/d，阴性对照组饲喂蒸馏水

根据发状根生物量低聚糖提取萃取率每克干样品数量，按阳性对照ginseng complex plus royal jelly的给药量折算出小鼠的给药量（见表1），以此配制药液，各称取90mg、70mg、50mg、30mg、10mg低聚糖干样及70mg阳性药及70mg发状根总苷于三角瓶，溶于20mL H2O，充分溶解，系好封口膜，标注记号。

取20±1g雄性BALB/C小鼠，随机分组，每组7只，按照表1分组，一共28组，共计196只。

通过灌胃的方式给予各组药物，每天1次，1次1只饲喂0.2mL给药组，周期10d，末次给药后进食10h，随后禁食。

第11天进行脱劲处死，并解剖小鼠取其肝脏液氮速冻后，置于-80℃冰箱保存备用。

表1 实验分组与剂量表

实验分组 药物名称 药物浓度/（mg/kg/d）

阳性对照组 ginseng complex plus royal jelly 7

阴性对照组 蒸馏水 –

总苷对照组 发状根总皂苷 7

给药组1 低聚糖组分A 9、7、5、3、1

给药组2 低聚糖组分B1 9、7、5、3、1

给药组3 低聚糖组分B2 9、7、5、3、1

给药组4 低聚糖组分C 9、7、5、3、1

给药组5 低聚糖组分D 9、7、5、3、1

1.2.2 指标测定

指标测定对象：小鼠肝脏提取液。

肝胆固醇的测定：总胆固醇酶氧化法；肝甘油三酯的测定：甘油三酯酶氧化法；过氧化氢酶的测定：可见光分光光度法；谷胱甘肽的测定：DTNB法。

1.2.3 数据分析

用SPSS 19软件进行统计学处理：单因素方差分析检验组间显著性差异，5%显著水平用*表示，1%极显著水平用**表示；主要成分分析（PCA）归纳具有生物相关性成分。

2 结果与分析

2.1 人参发状根低聚糖对小鼠肝脏谷胱甘肽的影响

对正常小鼠给药后，阳性药对照组及低聚糖给药组基本升高了小鼠肝谷胱甘肽含量，其中组分C在5mg/kg/d水平组的肝谷胱甘肽升高百分率为62.18%，与阳性药对照组肝谷胱甘肽升高百分率66.22%相比，水平基本相近，与阴性对照组比较差异极显著（P<0.01）。可见，发状根低聚糖可有效升高正常小鼠的肝脏谷胱甘肽水平（见表2）。

表2 肝脏谷胱甘肽GSH含量（mg/mL）

H2O 9mg/kg/d 7mg/kg/d 5mg/kg/d 3mg/kg/d 1mg/kg/d

阴性组 37.993±0.614 – – – – –

阳性组 – – 112.4793±0.717 – – –

总苷组 – – 98.9693±0.221 – – –

A – 36.0721±0.049 34.2108±0.717 50.8524±0.331 53.6788±0.653 23.9167±0.614

B1 – 57.5915±0.717 44.8561±0.501 46.5049±0.798 91.2571±0.922* 56.747±0.127

B2 – 20.9735±0.922 81.8232±0.819 29.7205±0.223 38.6515±0.364 44.4473±0.204

C – 11.4911±0.364 45.3812±0.508 100.4628±0.653** 36.0721±0.732 34.6558±0.522

D – 44.1021±0.221 30.1585±0.881 32.5391±0.512 22.3971±0.434 20.59±0.102

注：*为差异显著（P<0.05），**为差异极显著（P<0.01）

2.2 人参发状根低聚糖对小鼠肝脏总胆固醇的影响

对正常小鼠给药后，阳性药对照组及低聚给药组基本降低了小鼠肝脏总胆固醇含量，其中组分B2在5mg/kg/d水平组的肝胆固醇下降百分率为35.23%，与阳性药对照组肝胆固醇下降百分率35.68%相比，水平基本相近，与阴性对照组比较差异极显著（P<0.01）。可见，发状根低聚糖可有效降低正常小鼠的肝脏总胆固醇水平（见表3）。

表3 肝脏总胆固醇Total cholesterol含量（mg/mL）

H2O 9mg/kg/d 7mg/kg/d 5mg/kg/d 3mg/kg/d 1mg/kg/d

阴性组 5.0664±0.02 – – – – –

阳性组 – – 3.2587±0.0042 – – –

总苷组 – – 2.8663±0.0041 – – –

A – 4.2607±0.0024 4.6266±0.0052 4.4219±0.0069 4.5918±0.0076 4.1175±0.0085

B1 – 4.2907±0.037 4.4129±0.013 5.0389±0.008 3.9762±0.003 3.4338±0.0073

B2 – 4.1465±0.005 4.0715±0.012 3.2813±0.003** 4.6251±0.0014 4.6243±0.028

C – 5.0288±0.0032 4.5473±0.0012 3.3518±0.047* 3.9512±0.028 4.3858±0.0025

D – 4.3792±0.0023 4.6414±0.0032 3.8152±0.004 3.7778±0.0013 4.3269±0.0076

注：*为差异显著（P<0.05），**为差异极显著（P<0.01）

2.3 人参发状根低聚糖对小鼠肝脏甘油三酯的影响

对正常小鼠给药后，阳性药对照组及低聚糖给药组基本降低了小鼠肝脏甘油三酯含量，其中组分B2在5mg/kg/d水平组和组分C在7mg/kg/d水平组的肝甘油三酯下降百分率分别为33.17%、31.22%，与阳性药对照组肝甘油三酯下降百分率27.6%相比，水平基本相近，与阴性对照组比较差异极显著（P<0.01）。可见，发状根低聚糖可有效降低正常小鼠的肝脏甘油三酯水平（见表4）。

表4 肝脏甘油三酯Triglyceride含量（mg/mL）

H2O 9mg/kg/d 7mg/kg/d 5mg/kg/d 3mg/kg/d 1mg/kg/d

阴性组 2.1648±0.006 – – – – –

阳性组 – – 1.4467±0.0023 – – –

总苷组 – – 1.531±0.0031 – – –

A – 1.9875±0.0034 1.9735±0.0036 2.0248±0.0044 1.9104±0.0042 2.0127±0.009

B1 – 1.8308±0.0026 1.9653±0.0032 1.899±0.0074 2.0047±0.0054 2.1008±0.0034

B2 – 2.0488±0.0015 1.8979±0.0042 1.5672±0.001** 1.852±0.0032 1.7643±0.0042*

C – 1.9611±0.0034 1.489±0.0023** 1.5633±0.0044 1.9635±0.0048 2.0488±0.0043

D – 1.9431±0.0035 2.1952±0.0023 2.0563±0.0026 1.8928±0.0016 2.1108±0.0011

注：*为差异显著（P<0.05），**为差异极显著（P<0.01）

2.4 人参发状根低聚糖对小鼠肝脏过氧化氢酶活性的影响

对正常小鼠给药后，阳性药对照组及低聚糖给药组基本提高了小鼠肝过氧化氢酶的活性，其中组分C在5mg/kg/d水平组的肝过氧化氢酶酶活性升高百分率为68.28%，与阳性药对照组肝过氧化氢酶酶活性升高百分率69.99%相比，水平基本相近，与阴性对照组比较差异极显著（P<0.01）。可见，发状根低聚糖可有效地提高正常小鼠的肝脏过氧化氢酶酶活性水平（见表5）。

（注：1976年国际生化协会酶学委员会对酶活性单位定义为：在特定的条件下，1 min能转化1μmol底物的酶量，即1IU=1μmol/min。推荐采用国际单位（IU）来统一表示酶活性的大小。）

表5 肝脏过氧化氢酶CAT酶活性单位（IU）

H2O 9mg/kg/d 7mg/kg/d 5mg/kg/d 3mg/kg/d 1mg/kg/d

阴性组 305.1251±0.34 – – – –

阳性组 – 1016.7384±0.35 – – –

总苷组 – 621.9767±0.64 – – –

A 289.1447±0.84 274.9604±0.38 125.6012±0.27 171.034±0.74 144.6145±0.88

B1 396.9413±0.74 339.0024±0.74 408.7712±0.74 611.019±0.54 210.8157±0.54

B2 944.2217±0.43* 201.1598±0.63 339.1583±0.47 154.3688±0.18 159.9067±0.64

C 282.6878±0.63 651.1603±0.64 961.977±0.28** 344.068±0.43 336.9789±0.47

D 271.2865±0.74 480.3654±0.57 327.6615±0.47 299.0952±0.74 539.0581±0.47

注：*为差异显著（P<0.05），**为差异极显著（P<0.01）

2.5 活性实验数据主要成分分析（PCA）分析

由主要成分（PCA）分析旋转空间成分分布图（图1）所示：

第一生物相关性成分有谷胱甘肽、过氧化氢酶；

第二生物相关性成分有血糖、胆固醇、甘油三酯。

2.6 人参发状根低聚糖活性实验分析结果总结

通过以上1～5的结果综合分析可知，如表6所示。

表6

生物相关性成分 第一生物相关性成分 第二生物相关性成分

活性指标名称 谷胱甘肽、过氧化氢酶 胆固醇、甘油三酯。

活性寡糖组分 谷胱甘肽：C在5mg/kg/d

过氧化氢酶：C在5mg/kg/d 胆固醇： B2在5mg/kg/d

C在7mg/kg/d

甘油三酯：B2在5mg/kg/d

由表6可知，低聚糖剂量组B2在5mg/kg/d、C在5mg/kg/d水平组满足小鼠肝脏中肝脂和抗氧化能力生理指标的活性要求。

3 结论与讨论

本实验对人参发状根的次生代谢产物低聚糖的活性进行了探索，通过对PCA分析结果与单因素方差分析结果相结合，研究结果显示：人参发状根低聚糖C在5mg/kg/d水平上肝谷胱甘肽、肝过氧化氢酶活性相对阴性对照组均差异极显著升高，且略低于阳性药对照组水平，差异不显著。B2在5mg/kg/d水平上肝胆固醇、肝甘油三酯相对阴性对照组均差异极显著降低，且略高于阳性药对照组水平，差异不显著。说明了人参发状根低聚糖具有降肝脂，提高抗氧化等活性。

本实验对肝脏中总胆固醇，甘油三酯，还原型谷胱甘肽，过氧化氢酶活进行的测定方法，相比利用ELISA试剂盒来说，节约成本，且结果标准差小，对动物活性实验测定方法的汇总有着一定意义。

本实验利用的是正常雄性BALB/C小白鼠，相比利用建模型小鼠，虽然能够说明一定问题，但我们要从科研实验严谨度考虑，对下一步活性实验小鼠造模问题有待实施。

本实验以单因素方差分析与主要成分分析相结合的方式处理实验数据。对于两种分析方法相结合让活性数据分析更加系统化，能说明动物活性实验结果可靠，对于数据分析是本实验一大创新点。

肝脏是人体内脏中最大的器官，其中含有大量肝脂质和抗氧化酶，在脂质，抗氧化方面扮演着重要角色。本实验研究结果表明：人参发状根低聚糖对降肝脂，提高抗氧化能力有着明显影响，本实验的创新点在于检测了低聚糖对肝脏脂质和抗氧化酶的活性指标，对利用细胞工厂技术培育植物次生代谢产物，为新型降肝脂，抗氧化制剂研究提供一定的理论基础。

参考文献

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作者简介：王超（1989-），男，在读硕士，专业方向：生物大分子结构与功能。