用毛细管电泳测定牦牛乳中的乳清酸含量

于淼　任亮　蒋忠荣　黄林　金素钰　刘曦　郑玉才

摘要：建立了毛细管电泳（CE）测定乳中乳清酸含量的方法。用三氯乙酸提取昌台牦牛（Bos grunniens）和两种品牌液态乳脱脂乳中的乳清酸，然后用毛细管电泳进行分离和定量。对试验条件（缓冲液浓度、pH等）进行了优化，乳清酸色谱保留时间为15min左右，最小检测限为0，02mg/100mL，在检测范围内线性关系良好（R²=0.999），回收率为99.66%。试验共测定了12头处于泌乳中期的昌台牦牛乳中的乳清酸含量，平均含量为（5.2±2.4）mg/100mL，个体间含量差异较大。两种商业品牌的液态乳中乳清酸的含量平均为7.4mg/100mL，其中冷藏乳中乳清酸含量均高于常温乳，牦牛乳中的乳清酸含量低于商业液态乳。

关键词：牦牛（Bos grunniens）；乳清酸；乳；毛细管电泳

中图分类号：S823.8⁺5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2344-03

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原及毗邻高寒地区特有的牛种，是当地牧民重要的生活资料与创造财富的生产资料，也是青藏高原畜牧业的主体。牦牛乳的营养价值高于荷斯坦牛乳，其乳蛋白、脂肪、乳糖及干物质含量均高于其他牛种，是加工奶油制品的最优原料之一。牦牛乳中蛋白质平均含量约为5.24%，明显高于普通牛乳（3.40%）。此外，牦牛乳含有18种氨基酸，其中包括8种必需氨基酸，总含量比普通牛乳高15%：钙含量比普通牛乳高15%。目前对牦牛乳的研究主要涉及常规营养成分，而对微量组分的研究较少。进一步挖掘牦牛乳的优质特性，对于合理开发利用牦牛乳资源具有实际价值，也有利于青藏高原少数民族地区的畜牧业发展。

乳清酸（Orotic acid）是首先在牛奶中发现的核酸代谢物，后又发现存在于各种哺乳动物的乳汁中及多种变异微生物的嘧啶核苷酸的合成途径中。有研究表明，乳清酸会诱导脂肪肝的产生，并且乳牛的某些遗传性疾病会表现为乳中的乳清酸累积，因此测定乳中乳清酸含量对鉴定乳的品质具有重要意义。国内外现采用多种方法测定乳清酸，常见的有高效液相色谱法（HPLC）、色谱一质谱联用法、电化学分析法。毛细管电泳技术是一种发展十分迅速的色谱分离定量技术，具有快速、灵敏度高、进样量少等优势，应用范围广。有关牦牛乳中乳清酸含量的分析尚未见报道，本试验用毛细管电泳法对牦牛乳中的乳清酸的含量进行了测定，以期为牦牛乳的品质分析提供方法。

1 材料与方法

1.1 样品的采集和处理

夏季采集四川省甘孜州昌台牦牛的乳样，12头处于泌乳中期的昌台牦牛采用全天然放牧方式饲养，于早晨手工挤奶。全乳经2000r/min离心20min，抽取下层脱脂乳，80℃保存备用。本试验还在超市中购买了两种品牌的液态全乳，每种品牌中冷藏奶（2～6℃贮存）和常温奶各选一种，处理方法同上。

乳中的乳清酸参照Saidi等的方法提取待测。

1.2 主要仪器与试剂

P/ACEMD0毛细管电泳仪（美国Beckman公司）；Z323K高速冷冻离心机（德国Hennle公司）；DELEA320pH计（瑞士MettlerToledo公司）：SB-5200DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）：WPABiowaveⅡ分光光度计（英国Biochrom公司）等。毛细管全长57cm，有效长度50cm，内径75μm，运行时柱温控制为25℃。

1.3 试验方法

1.3.1 标准品的配制 准确称取乳清酸标准品（Sigma公司）50mg，加适量1mol/L的KOH助溶，加去离子水并用三氯乙酸调节标准品溶液oH至2.75（与样品oH相接近）后，加去离子水定容到50mL。用三氯乙酸调节去离子水pH至2.75，用此酸水将标准品稀释为7个浓度（0.2-8.0mg/100mL），用于制作标准曲线。

1.3.2 分析条件 试验所有毛细管柱为Beckman非涂层毛细管（57cm×50cm，75μm）。运行缓冲液为50mmol/LKH₂PO₄与50mmol/LNa₂B₄O₇等体积混匀的硼酸一磷酸缓冲液，pH6.5，0.45μm水性膜过滤，4℃保存备用。参数设定：柱温25℃，检测波长280nm。毛细管柱在每次进样前分别用超纯水和0.1mol/LNaOH冲洗10min，再用运行缓冲液冲洗5min。更换样品前，应在20Psi下用0.1mol/LNaOH冲洗5min。超纯水冲洗5min，运行缓冲液冲洗10min。进样时间为5s。0.5Psi。运行缓冲液20kV洗脱20min后进行分离定量测定。

1.3.3 加标回收率测定 向已知乳清酸含量的样品中加入相同量的标准品，再测定乳清酸含量。根据公式计算回收率：加标回收率=（加标试样测定值-试样测定值）/加标量×100%。

1.3.4 精密度测定 重复6次测定乳清酸标准品溶液（4mg/100mL）中乳清酸含量，以峰面积计算精密度。

2 结果与分析

2.1 毛细管电泳测定乳清酸方法的建立

试验分析显示，毛细管电泳测定乳清酸方法中，运行缓冲液的pH对样品的分离度有很大影响。如以pH5.5的磷酸一硼酸缓冲液为运行缓冲液时，分离峰有拖尾等现象。经多次优化，确定运行缓冲液为50mmol/L的磷酸一硼酸缓冲液，pH6.5。

由图1可见，优化电泳条件后可获得较好的乳清酸电泳图谱，峰形对称、无拖尾现象。牦牛乳中乳清酸的保留时间为（15.9±0.6）min，商品液态奶乳清酸的保留时间为（13.7±0.1）min，图2为某一牦牛乳中乳清酸毛细管电泳情况。

在试验测定范围内，乳清酸标准品浓度与峰面积呈良好的线性关系（图3），以峰面积计算精密度为1.8%，最小检测值为0.02mg/100mL。试验测定的加标回收率平均值为（99.66±2.89）%。

2.2 牦牛乳和商业奶中乳清酸含量

本研究显示。昌台牦牛乳（n=12）中乳清酸平均含量为（5.2±2.4）mg/100mL，范围在2.2～9.9mg/100mL之间，个体间含量差异较大。在商业奶中，两种冷藏奶平均含量为8.2mg/100mL，两种常温奶平均含量为6.6mg/100mL。冷藏奶中的乳清酸含量均稍高于常温奶。昌台牦牛乳中的乳清酸平均含量均低于商业奶。

3 讨论

乳清酸是哺乳动物从头合成尿苷及其衍生物的重要中间物。乳清酸可能是脂肪肝的化学诱导因素之一，但其机制还不确定。乳清酸在乳中的含量并不高，但患有亚临床乳腺炎的奶牛，乳中乳清酸含量显著增高。另外，患尿苷酸核酶缺乏症（DUMPS）的奶牛，乳中有乳清酸累积现象。因此，检测乳中的乳清酸含量对于监测乳的品质和筛查奶牛是否患有DUMPS具有实际意义。现普遍认为乳清酸可能会影响脂肪酸氧化，促进脂肪合成，减少脂肪在肝中的运输。人们日常饮食中乳清酸基本来自乳和乳制品，乳清酸的摄取量并不高，若另摄取一些乳清酸含量高的营养保健品，则可能对人体产生负面影响。

乳清酸含量的分析方法较多，常见的有色谱一质谱分析法、HPLC法、电化学分析法等。色谱一质谱法多用于测定尿液与血浆中乳清酸含量，乳清酸与重氮结合后便于分离，适合GC/MS测定。该方法测定健康人尿中乳清酸含量与毛细管电泳法结果一致，但分离测定方法上较为繁琐。HPLC法因具有灵敏度高、重现性好、操作简单等特点而应用广泛。Tonno等用HPLC法测定乳制品中11种有机酸的含量，其中测定乳清酸含量的精密度为1.85%，最小检测限为0.6mg/100mL。HPLC法测定不同物质需用不同的色谱柱。测定乳清酸含量用反相色谱柱，而毛细管电泳法只需要彻底清洗毛细管即可测定很多物质，降低了测定成本。王福民等用极谱法测定了牛奶中乳清酸的含量，检测限为0.015mg/100mL。此方法需25mL以上的样品，而毛细管电泳法可实现微量测定。牦牛乳中的乳清酸含量测定尚未见报道，本研究建立了毛细管电泳测定牦牛乳中乳清酸含量的方法，线性关系好，检测限低（0.02mg/100mL）。适合于微量乳样中乳清酸的定量。检测成本低、方法简便。可用于牦牛乳中乳清酸含量的大规模监测。

牛乳中代谢物含量受地理分布、饲料和遗传背景等的影响，这些因素可进一步影响乳的营养特性和加工工艺。牦牛终年采食天然牧草，不使用饲料添加剂，是优质的乳资源。本研究测定牦牛乳中乳清酸平均含量为（5.2±2.4）mg/100mL。商业奶乳清酸平均含量为7.4mg/100mL。不同的研究显示，荷斯坦牛乳中乳清酸含量范围为6.7-8.1mg/100mL。牦牛乳中蛋白质、脂肪和矿物质等营养成分含量高，而具有相对较低的乳清酸含量，这一组成特性对人体健康是有益的。本研究结果进一步揭示出牦牛乳的优良品质特性。