豇豆叶喷细胞分裂素后光谱、荧光参数与叶绿素含量的相关性分析

胡志辉　汪艳杰　兰红　郭瑞　陈高　陈禅友

摘要：试验对豇豆（Vigna unguiculata）叶片进行了叶绿素荧光仪和光谱仪参数的测定，以及用传统方法测定了叶片叶绿素含量，筛选了17个指标进行相关分析和逐步回归分析。结果表明，PAR与NPO、Y（NPO）、Fm差异极显著，Y（Ⅱ）与Y（NO）差异极显著，qL与PRI差异显著，呈显著负相关，其他指标间差异都不显著。CR，1与CNDVI差异显著，CNDVI与CRI1、PRI差异显著，呈显著负相关，与ARI1差异极显著，呈显著正相关，NDVI与PSRI差异极显著，呈显著负相关。通过逐步回归得到的6个显著指标对叶绿素的直接作用为：Y（NPQ）（X₆）>ARI1（X₁₅）>Fm（X₁₄）>PRI（X14）>qL（X₄）>NPQ（x₄）。Y（NPQ）和ARI1两个自变量对目标性状具有较大的直接通径系数，qL和NPO对叶绿素含量的直接通径系数均较小。NPO对叶绿素含量的影响主要是通过Y（NPO）、Fm、PRI，ARI1发生的，PRI对叶绿素含量的影响主要是通过ARI1发生的。可以采用回归方程快速拟合豇豆叶片叶绿素含量的值。

关键词：豇豆（Vigna unguiculata）；荧光；光谱；叶绿素含量；相关分析；逐步回归

中图分类号：S643.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2290-05

光合作用是绿色高等植物从外界环境获取能量的途径，是进行各项生命活动的基础。叶绿素是植物进行光合作用的重要物质，叶绿素含量的高低直接影响到植物光合作用的速率和强度，从而影响植物的产量。当植物发生衰老时，叶绿素含量降低，叶绿素含量可作为衰老的一个指标。张治礼等认为叶片衰老将严重影响有效光合作用时间和营养体构建，最终影响子粒产量。植株叶片吸收的光能一部分被叶绿素利用进行光合作用，另一部分以长波的形式散发荧光，或者以热的形式向外耗散。将绿色植物组织暗适应后，在可见光下激发。用荧光计检测。可发现植物绿色组织发出一种微弱的、强度不断变化的荧光信号，即为叶绿素荧光动力学。叶绿素荧光参数与光合作用中各种反应过程密切相关，任何环境因子对光合作用的影响都可通过叶片叶绿素荧光动力学反映出来。随着遥感技术的发展，利用特殊波段的光谱反射率来估计植物叶绿素含量越来越受重视。杨峰等认为根腐病胁迫下光谱特征指数和叶绿素荧光参数与光合色素之间存在很好的相关性。因此，高光谱遥感技术作为监测作物光合色素和叶绿素荧光参数的方法具有可行性。国内外大量研究表明，有目标地调节植物内源激素系统，是保障品种优良遗传性状和抗逆潜能充分发挥的新技术资源。在植株的不同生育阶段或者外界环境胁迫条件下喷施植物生长调节剂，会发现植株的叶绿素含量发生不同程度的变化，从而影响植株的光合速率。

细胞分裂素能刺激植物细胞分裂，促进叶绿素形成，增强植物光合作用。具有促进生长，提早成熟，催花保果，增加产量等功能。研究喷施细胞分裂素后植物叶片光谱参数、荧光参数的变化，能够在微观层次上了解植物光合系统的光能吸收、转换和利用效率，探明细胞分裂素对植物的作用机理。因此，针对上述问题，以通过国家审定的适合在湖北种植的4个豇豆（Vigna unguiculata）品种为试验材料，应用细胞分裂素为调控手段，检测豇豆叶片叶绿素含量的变化，以期提高豇豆光合能力，从而为提高豇豆的产量提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

鄂豇豆6号（商品名柳翠），植株蔓生，生长势强。分枝少，持续结荚能力强，中熟，荚绿色。长圆条形。鄂豇豆2号（商品名早翠），植株蔓生，生长势旺。无分枝或1个分枝：始花节位3～4节，早熟，荚浅绿色，长圆条形。鄂豇豆7号（商品名矮虎），短蔓型，植株生长势强。分枝较多。茎粗壮。节间长度中等，早熟，适于爬地栽培；美国地豆（代号地豆），短蔓型，植株生长势强，分枝较多，茎粗壮。节间短。中熟。以上品种均由湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心提供。

1.2 试验设计

各豇豆品种于2014年8月22日播种于江汉大学湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心基地，按照最适宜密度种植，随机区组排列，3次重复。深沟高畦，畦面平整，畦宽1.33m，畦植2行，穴距25cm，每穴2株，小区面积为6.65m²，以小区实际产量折算成667m²产量。按常规栽培进行田间管理。

1.3 供试植物生长调节剂

在现蕾期对试验材料叶面喷施由海南博士威能农用化学有限公司研制的细胞分裂素，活性成分为烯腺嘌呤、羟烯腺嘌呤。总有效成分含量为0，004%。以喷等量清水的处理作为对照。分别于喷施7、14、28、42d后用光谱仪和叶绿素荧光仪测定相关参数。

1.4 项目测定

荧光动力学参数的测定：采用德国WALZ生产的多通道连续监测荧光仪Monitoring-PAM，于晴天或少云天气9：00左右，在观测植株群体中挑选有代表性的3片叶片。按照顺序进行标记，暗适应15min后测定激光激发的叶绿素荧光参数，测定3次，取平均值。测定项目有PAR（X₁）、y（Ⅱ）（X₂）、qL（X₃）、NPQ（X₄）、Y（NO）（X₅）、Y（NPQ）（X₆）、Fo（X₇）、Fm（X₈）、Fv/Fm（X₉）依次代表暗适应下的光合有效辐射、光化学转化能量的比例即PSⅡ实际量子产量、光化学淬灭系数、非光化学猝灭系数、PSⅡ处非调节性能量耗散的量子产量、PSⅡ处调节性能量耗散的量子产量Y（NPQ）、基础荧光、最大荧光和PSⅡ原初光能转化效率。

光谱仪参数的测定：与叶绿素荧光测定同步，采用美国生产的CI-710植物叶片光谱仪（波段范围400-1000nm）测定不同豇豆品种叶片的光谱反射率。在9：00-11：00，测定时叶片平放，测定叶片朝向一致，每次测定3片叶片，取平均值作为该叶片的反射光谱参数的测量值。测定项目有CRI1（X₁₀）、CNDVI（X₁₁）、NDVI（X₁₂）、WBI（X₁₃）、PRI（X₁₄）、ARI1（X₁₅）、PSRI（X₁₆），计算公式见表1。

叶绿素含量测定：鲜叶剪碎，取0.1g放入10mL混合提取液（乙醇：丙酮：水：4.5：4.5：1.0）中。在黑暗环境下浸泡提取。直至叶片完全变为白色为止，以提取液为对照，取浸提液分别在紫外分光光度计上测定OD_645nm～OD_663nm。叶绿素（a+b）含量单位为mg/g。

1.5 数据分析

以叶片叶绿素含量（Y）为试验研究的目的性状。采用DPS7.05软件进行相关与回归分析。

2 结果与分析

2.1 光谱、荧光参数与叶绿素含量相关性

试验对PAR（X₁）、Y（Ⅱ）（X₂）、qL（X₃）、NPQ（X₄）、Y（NO）（X₅）、Y（NPQ）（X₆）、Fo（X₇）、Fm（X₈）、Fv/Fm（X₉）、CRI1（X₁₀）、CNDVI（X₁₁）、NDVI（X₁₂）、WBI（X₁₃）、PRI（X₁₄）、ARI1（X₁₅）、PSRI（X₁₆）与叶片叶绿素含量共17个指标进行了相关分析，分析结果如表2所示。从表2可以看出。光合有效辐射值PAR与NPQ、Y（NPQ）、Fm差异极显著，其中Fm的相关系数绝对值最大（0.99）；其次是Y（NPQ）和NPQ，相关系数分别为-0.84和-0.82。Y（Ⅱ）与Y（NO）差异极显著，qL与PRI差异显著，呈显著负相关，其他指标间差异都不显著。CRH与CNDVI差异显著，CNDVI与CRI1、PRI差异显著，呈显著负相关，与ARI1差异极显著。呈显著正相关。NDVI与PSR1差异极显著，呈显著负相关。

2.2 光谱、荧光参数与叶绿素含量的多元回归与通径分析

为进一步明确荧光动力学参数和光谱参数对叶绿素含量的直接和间接作用，对16个自变量与叶绿素含量进行了逐步回归分析。具体试验以荧光动力学参数、光谱参数16个指标为自变量。叶片叶绿素含量为目标性状，进行逐步回归分析，得到回归方程：

Y=-36.5484+4.0498X₃+25.5160X₄+401.3969X₆+0.0073X₈+77.0011X₁₄+396.2878X₁₅，

该方程的决定系数为0.9999，剩余通径系数为0.0089。显著性检验结果表明，回归方程的方差达显著水平（P=0.0167）。回归方程中各偏回归系数表明，qL每增加1个单位，叶绿素含量增加4.0498mg/g：NPQ每增加1个单位，叶绿素含量增加25.5160mg/g；Y（NPQ）每增加1个单位，叶绿素含量增加401.3969mg/g；Fm每增加1个单位，叶绿素含量增加0.0073mg/g；PRI每增加1个单位，叶绿素含量增加77.0011mg/g；ARI1每增加1个单位，叶绿素含量增加396.2878mg/g。

为进一步确定各参数对叶绿素含量的影响和作用方式，对与豇豆叶片叶绿素含量极显著相关的6个指标进行了通径分析，结果见表3。从表3可以看出，6个显著指标对叶绿素的直接作用为：Y（NPQ）>ARI1>Fm>PRI>qL>NPO。Y（NPO）和ARI1两个自变量对目标性状具有较大的直接通径系数，分别是2.8667和2.0619，说明这两个自变量对叶绿素含量的直接正向影响力较高。而qL和NPQ对叶绿素含量的直接通径系数均较小，分别为0.6088和0.1282。在间接通径系数中，通过Y（NPO）的各间接通径系数均较大，分别为-1.5775（qL）、2.7134（NPQ）、-2.5252（Fm）、-0.5416（PRI）、-1.1497（4RI1）。此外，NPO通过Y（NPO）、Fm、PRI、ARI1的间接通径系数大于其直接通径系数，说明NPO对叶绿素含量的影响主要是通过Y（NPO）、Fm、PRI、ARI1发生的。PRI通过ARI1的间接通径系数大于其直接通径系数，说明PRI对叶绿素含量的影响主要是通过4RI1发生的。

2.3 细胞分裂素处理后叶绿素含量的拟合

在喷施细胞分裂素28d后，即盛荚期测定4个品种豇豆叶片叶绿素含量，并用“2.2”中的叶绿素含量回归方程拟合叶绿素含量的值，计算拟合相对误差，结果见表4。从表4可以看出，叶绿素拟合的相对误差较小，因此可以采用回归方程快速拟合豇豆叶片叶绿素含量的值。

2.4 豇豆不同成熟度叶片的光谱值

采用Duncan新复极差法对豇豆矮虎不同成熟度叶片的各个光谱指数进行显著性分析，结果见表5。从表5可以看出，老叶、幼嫩叶的CRI1与成熟叶的CRI1值差异显著，老叶与幼嫩叶的CRI1值差异不显著。3种不同成熟度叶片的CNDVI、WBI、RENDVI值差异极显著。老叶与成熟叶的NDVI、PRI值差异显著，其他差异不显著。3种不同成熟度叶片的ARI1值差异不显著。PSRI是植被衰老反射率指数，老叶、成熟叶、幼嫩叶的PSRI指数差异显著，老叶的PSRI指数最高，幼嫩叶的PSRI指数最低。

3 小结与讨论

植株由营养生长进入到生殖生长时，此时体内营养物质供需不平衡，导致营养器官产生早衰现象。叶绿素是植物光合作用的主要色素，含量高低直接决定植物光合作用强度，对植物生长发育有重要的影响。一般认为，叶片中的叶绿素含量较高时，其光合速率也较高，故可以运用叶绿素含量来评价植物的环境和营养状况。

植物的叶绿素荧光信号包含大量的光合作用信息，通过叶绿素荧光可以反映叶片的光合能力。可以保护光合机构免受伤害，减少光诱导损伤。PSⅡ的热耗散增加，F₀降低，PSⅡ反应中心的破坏或可逆失活时F₀增加，可以凭借F₀的变化情况推断反应中心的状况；F₀大小与叶绿索的含量有关，F_m大小与OA的氧化还原状态有关，F₀和F_m的下降可能是花青素吸收了叶绿素荧光仪的测量光，降低了叶绿素荧光的发射强度。光化学淬灭系数qL是PSⅡ天线色素吸收的太阳光能用于化学电子传递的比例，qL低表明PSⅡ开放反应中心的比例以及参与CO₂固定的电子减少：Y（NPO）是光保护的重要指标，若调节性能量耗散的量子产量Y（NPO）较高，表明植物获得的光强过剩，同时表明植物仍然能够通过调节来保护自身，比如将过剩的光能耗散为热能。NPO是PSⅡ天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而耗散掉的部分光能，对光合机构起一定的保护作用。

逆境水稻叶片中的F_v/F_m、实际量子效率（ΦPSⅡ）、qP显著下降，说明PSⅡ反应中心受到伤害，而耐性品种可通过热耗散耗散掉其过剩的激发能，从而保护光合系统。当叶片内部叶绿素含量低时，可能会造成光化学反射指数和光能利用率之间关系的削弱。外源激素CTK可以阻止叶绿体和光合蛋白的降解，延缓叶片衰老过程，延长叶片持绿时间，延长叶片的光合作用时间，能够提高和延长植株群体光合速率，从而提高植株产量。本试验中，在盛荚期，除早翠外，叶面喷施细胞分裂素的柳翠、矮虎、美国地豆3个豇豆品种叶绿素含量较喷施等量清水的对照组高。因此，在盛荚期可以通过喷施外源细胞分裂索来增加叶绿索的含量，从而提供充足的营养，

叶绿素能够吸收红光和蓝光，以及对绿光的反射，使植被具有独特的光谱特征，为植物光谱指数估算叶绿素含量提供了可能性。对始花期大豆叶片光合色素、叶绿素荧光参数和光谱指数进行相关分析，发现光合色素与GNDVI等的相关性和荧光参数与PSRI等的相关性均达到显著或极显著水平，表明大豆叶片叶绿素荧光特性与其光谱特征指数之间存在着相关性。Dauffhtrv等发现550nm处玉米叶片的光谱反射率与叶绿素含量显著相关。PRI对活体植物的类胡萝卜素变化非常敏感，类胡萝卜素可表征光合作用光的利用率，或碳吸收效率。本试验显示PRI、ARI1增加时，叶绿素含量相应增加，呈正比关系。

光照是影响花青索合成的重要因子。李运丽等认为，叶片在强光条件下可以合成大量的花青素，提高Fv/Fm适应强光环境，叶片在弱光条件下可以抑制花青素的合成来维持植株的正常生长。花青素通过反射和吸收部分太阳光，减弱到达叶绿体的光强。从而保护叶绿体，减轻光抑制。本试验测定的叶绿素含量是叶绿素a和b的总量，叶绿素含量与CRI1（类胡萝卜）、PSRI、PRI负相关，而与ARI1花青索正相关。本试验对豇豆品种矮虎不同成熟度叶片的光谱指数进行了测量，结果发现，老叶、幼嫩叶与成熟叶的CRI1值差异显著，CNDVI、WBI、RENDVI值差异极显著，PSRI指数差异显著，ARI1值差异不显著，说明叶片的衰老与光合色素的光谱指数有一定的相关性。

逐步回归分析表明，叶片叶绿素含量是多重因素综合作用的结果，各个因子之间互相联系、互相影响。进行通径分析，尽可能地考虑到所有的影响因子，才能取得更为精确的结果。本试验最终筛选出qL、NPO、Y（NPO）、Fm、PRI、ARI1共6个显著指标来拟合植株叶片叶绿素含量的高低，在实际生产过程中。可以采用一些生产措施例如施肥、喷施植物生长调节剂来提高植株叶片叶绿素含量，从而提高光合速率和产量，其中可以利用豇豆叶片叶绿素荧光特性与其光谱特征的相关性，可为利用高光谱遥感技术对豇豆光合生理生态的监测提供理论依据。