不同冻存液对无血清BHK21细胞冷冻效果的影响

郭海平 李培林 赵子红 哈申高娃 郭冠萍/金宇保灵生物药品有限公司



不同冻存液对无血清BHK21细胞冷冻效果的影响

郭海平 李培林 赵子红 哈申高娃 郭冠萍/金宇保灵生物药品有限公司

在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的今天，细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。冷冻保存是细胞长期保存的唯一方法，有利于减少细胞被微生物污染和细胞之间交叉污染的危险性，减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变以及避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。大多数的细胞若无特别的要求，都可冷冻保存于-130℃以下长达多年。动物细胞冷冻保存，为细胞培养工作带来很大的机动灵活性，降低了人力和物力的消耗。但是细胞经冷冻以后，复苏后的活力始终是细胞工作者最关心的问题之一，怎么样才能保证细胞在冻存的过程中受到的损伤最小？怎么样才能使细胞复苏后的活力以及细胞形态与冷冻之前的差异最小？这一直是我们努力的方向。近年来，培养基的发展很迅速，从正常血清到低血清的培养基，现在已经推出了无血清培养基甚至是CD培养基，相应就会有低血清细胞，以及无血清细胞。血清在细胞的生长过程中起到了很重要的作用，有很多未知的成分对细胞有重要的影响。而体外培养的细胞在无血清的培养基中，非常脆弱，对各种因素十分敏感，那么在无血清细胞的冻存过程中，怎样能保证细胞的最高活力，这是一个新的课题。有很多的因素会影响解冻后的细胞的存活率，例如细胞的冷冻密度、冻存液的配方以及冷冻程序，细胞的解冻温度等都会对细胞的冻存效果有影响。本实验就冻存液的配方对无血清BHK21细胞活力的影响做了分析，这将会在生产中有一定的指导意义。

一、材料

1.细胞株。BHK21细胞来自金宇保灵生物药品有限公司。

2.试剂。培养液购自CIBCO公司；新生牛血清购自内蒙古维克生生物科技有限公司；甲基纤维素购自天津博迪化工股份有限公司；台盼蓝购自SIGMA公司；DMSO （D2650）购自SIGMA-ALDRJCH 公司。

3.其它实验器材和仪器。超净工作台(YJ-1450)购自吴江市江南净化工程有限公司；离心机（DL-5-B）购自上海安亭科学仪器厂；冰箱（SC-276）购自青岛海尔电冰柜有限公司；倒置显微镜（CKX41）OLYMPUS；液氮罐（YDS-30-125F）购自乐山市东亚机电工贸有限公司；50 ml离心管，冻存管购自corning公司；移液器购自芬兰雷伯；镊子、防冻手套、防护面罩、血球计数板、经校验的温度计均由金宇保灵生物药品有限公司提供。

二、方法

用对照、实验1和实验2三种不同的冻存液冻存同一批细胞，在细胞冻存半年后同时进行复苏，每种冻存的细胞复苏2支，检验冻存效果，计算复苏活力。重复进行三次冻存实验。

1.冻存液的配制。对照冻存液：7.5％ DMSO，92.5％培养液；实验1冻存液：7.5％ DMSO，10％血清，82.5％培养液；实验2冻存液：7.5％ DMSO，10％甲基纤维素，82.5％培养液。

2.细胞的离心。取对数生长期的细胞，倒入离心管中离心900 r/m，5 min。

3.细胞的分装及冻存。细胞离心后，弃上清，用已经配制好的3种冻存液重悬细胞，然后分装入冻存管中，每管1.5 ml。按以下程序进行冻存：4℃放置1 h，-20℃放置2 h，液氮口放置0.5 h，放入液氮中。

4.细胞复苏。细胞冻存半年后进行复苏，每种细胞复苏2支，计算其平均活力。从液氮中取出冻存管直接放入37℃温水中，并不时摇动使其在1～2 min内尽快融化。融化后离心720 r/m，5 min，弃上清，每支管中加入1 ml培养液，计数，计算其活力。细胞计数：4大格细胞总数÷4×104×稀释倍数。细胞活力=活细胞数÷细胞总数×100％。

三、结果与分析

1.冻存前细胞的密度和活力。结果见表1，三次试验的细胞的活力都在95％以上，符合冻存标准。

表1　冻存前细胞的密度和活力

2.复苏后细胞的密度和活力。结果见表2。

表2　复苏后细胞的密度和活力

表2结果显示，共进行了三次冻存实验，从复苏活力的平均值来看，对照的复苏活力三次都是最低的，其中的1次低于90％，而实验1和实验2的复苏活力均比对照的高，均在90％以上，而且实验1的复苏活力是最高的。

四、讨论

细胞冻存在细胞培养中是一个非常重要的环节，细胞冻存效果的好坏直接影响细胞复苏后的成活率以及后期的繁殖。尤其是对于无血清BHK21细胞的冻存，无血清的细胞非常脆弱，很容易受到外界因素的影响。本文就不同配方的冻存液来冻存无血清BHK21细胞，复苏后检验其复苏活力，进行了三次平行试验，结果显示，含有血清和甲基纤维素的冻存液冻存的细胞，复苏后的复苏活力比对照高。可能是由于在细胞的冻存过程中，血清和甲基纤维素起到了一定的保护作用，减少了细胞在冻存过程中受到的损伤，因此表现出细胞的复苏活力高。因此建议在无血清BHK21细胞的冻存中，冻存液中最好添加血清或甲基纤维素，以提高保护性能。

在本实验中，涉及到了很多需要细胞计数的工作，但是实验中的所有数据都是人工计数得出，可能存在人为误差，对实验结果有一定影响，但是由于数据都是由固定的人员来做的，可能对实验结果影响不大，需要以后继续开展实验，累积数据。

五、小结

本实验比较分析了3种不同配方的冻存液对无血清BHK21细胞冻存效果的影响，发现添加血清的冻存液在细胞冻存的过程中比其它2种冻存液有更好的保护效果。

参考文献(略)

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