全血γ-干扰素释放试验在结核病辅助诊断中的价值

李同心 何瑛 周刚 陈耑耑 魏成丽 刘敏 黄忠民 王静 钟敏 罗明 丁显平



·论著·

全血γ-干扰素释放试验在结核病辅助诊断中的价值

李同心 何瑛 周刚 陈耑耑 魏成丽 刘敏 黄忠民 王静 钟敏 罗明 丁显平

目的 评价全血γ-干扰素释放试验(interferon gamma release assay,IGRA)- QuantiFERON@-TB Gold IT试验试剂盒在结核病辅助诊断中的价值。方法 搜集重庆市公共卫生医疗救治中心结核科和感染科2014年7月1日至2015年12月31日期间同步进行痰液抗酸杆菌涂片、快速培养(BACTECTMMGITTM960)及采用IGRA测定外周血结核分枝杆菌抗原特异性γ-干扰素(IFN-γ)应答水平的1440例患者临床资料，采用卡方检验分析不同类别患者间不同检测技术阳性率的差异，以P<0．05为差异具有统计学意义。 结果 与临床诊断结果相比，IGRA检测全血诊断结核病的敏感度为77.6%(716/923)，特异度为69.9%(158/226)。与痰涂片[肺结核、肺外结核、HIV感染或AIDS患者并发肺结核的阳性率分别为28.5%(226/792)、 5.3%(7/131)、 6.1%(6/98)]、液体培养[肺结核、肺外结核、HIV感染或AIDS患者并发肺结核的阳性率分别为40.9%(324/792)、13.0%(17/131)、11.2%(11/98)]检测结果相比，IGRA诊断肺结核[77.0%(610/792)]、肺外结核[80.9%(106/131)]和HIV感染或AIDS患者并发肺结核[50.0%(49/98)]的阳性率更高，差异有统计学意义(与痰涂片比较，χ2值分别为373.52、152.51、46.73,P值均<0.01；与液体培养比较，χ2值分别为212.03、121.38、34.68,P值均<0.01)。结论 IGRA检测快速便捷，有着较高的敏感度。IGRA对结核病辅助诊断有一定的价值，尤其对肺结核、肺外结核，以及HIV感染或AIDS并发肺结核患者的诊断有一定意义。

结核； 分枝杆菌, 结核； 酶联免疫斑点检测； 分子诊断技术； 评价研究

结核病是一种长期危害人类身体健康的慢性传染病，是我国防治政策规定的重大传染病之一。快速、准确地诊断结核病一直是临床检测上的难点和热点。虽然细菌学诊断结核病是临床诊断的“金标准”，但也面临诸多问题；比如，抗酸杆菌涂片检测阳性率低，结核分枝杆菌培养周期长，组织病理学检查多为有创性等。我国菌阴肺结核约占所有肺结核患者的60%～70%[1]，肺外结核病约占结核病的5%～30%[2]，因此亟需一种更快速、更准确的实验室诊断方法辅助临床诊断。

γ-干扰素释放试验(interferon gamma release assay,IGRA)是近20多年来结核分枝杆菌感染免疫诊断的最重要的进展之一，目前作为一种新的辅助诊断结核分枝杆菌感染的免疫学方法，已经被广泛应用于临床并得到认可。IGRA主要原理是检测全血和(或)外周血单核细胞在结核分枝杆菌特异性抗原刺激下释放γ-干扰素的水平，判断受试者是否感染结核，目前主要应用酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)[3-5]或酶联免疫吸附法(enzyme linked immune sorbent assay,ELISA)[6-7]来检测。相对结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST)而言,IGRA通过检测结核分枝杆菌特异性抗原刺激下释放γ-干扰素(IFN-γ)的水平，从而有效地区分结核分枝杆菌感染和BCG疫苗接种引起的免疫应答[6-7]。目前，被美国和中国FDA批准应用于临床的较为成熟的IGRA试验方法主要有两种，一种是QuantiFERON@-TB Gold IT试验(QFT-GIT),另一种是结核感染T细胞酶联免疫斑点试验(T-SPOT.TB)。

本研究采用QFT-GIT对结核分枝杆菌感染的患者和HIV感染并发结核分枝杆菌感染的患者进行检测，探讨IGRA在结核病辅助诊断中的价值,结果报告如下。

资料和方法

一、研究对象、试验仪器及试剂

1.患者来源：收集重庆市公共卫生医疗救治中心结核科和感染科2014年7月1日至2015年12月31日期间同步进行痰液抗酸杆菌涂片、快速培养(BACTECTMMGITTM960)及采用IGRA测定外周血结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ应答水平的1440例患者，其中男959例，女481例，年龄范围10～85岁，平均年龄(43.4±17.5)岁。110例HIV感染或AIDS并发肺结核的患者临床血液检测HIV抗体为阳性,并经重庆市HIV确证实验室确认。所有肺结核和非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)肺病诊断均符合中华医学会结核病学分会制定的肺结核诊断标准[8]和NTM肺病诊断标准[9]，所有患者(无严重的肝肾功能衰竭史，结核病患者无免疫系统疾患)血样采集均在入院初期、使用免疫抑制剂或增强剂之前。

2.主要仪器及试剂来源：本研究使用的抗酸染色液购自珠海贝索生物技术有限公司。FACS Calibur流式细胞仪、CD4+T淋巴细胞绝对计数管和BACTECTMMGITTM960分枝杆菌培养检测系统、PAN-TA杂菌抑制剂、分枝杆菌培养管(MGIT)及营养添加剂(OADC)均来源于美国BD公司。噻吩-2-羧酸肼(TCH)和对硝基苯甲酸(PNB)罗氏培养基购自珠海银科医学工程有限公司。结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64抗原检测试剂盒(胶体金法)购自杭州创新生物检控技术有限公司。QFT-GIT检测试剂盒和专业分析判读软件均来源于Cellestis Limited制造商。GF-M3000型酶标仪由山东彩虹仪器有限公司生产。PW-960型自动酶标洗板机由深圳市汇松科技发展有限公司生产。

3. 研究对象资料来源：医院信息系统(hospital information system，HIS；为上海瑞美电脑科技有限公司生产)和实验室信息系统(laboratory information system，LIS；为上海瑞美电脑科技有限公司生产)。

二、方法

1.标本采集：痰液留取参照中国防痨协会《结核病诊断细菌学检验规程》[10]，无痰患者可采取雾化引痰或通过纤维支气管镜取痰，痰液不合格者，需进一步指导后重新留取标本送检。

2.痰涂片镜检和分离培养：痰涂片按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》的要求处理[11]，采用萋-尼染色法镜检。痰液培养前处理按照《分枝杆菌分离培养标准化操作及质量保证手册》[12]中关于碱处理-中和离心沉淀法的要求进行，并按照BACTECTMMGITTM960分枝杆菌痰培养操作说明书将前处理后的沉淀物接种于MGIT。

3.菌种鉴定：所有患者分枝杆菌培养产物均采用如下鉴定：(1)参照中国防痨协会《结核病诊断细菌学检验规程》[10]，使用TCH和PNB进行分枝杆菌菌种初步鉴定试验，TCH、PNB药物终浓度分别为5 μg/ml、500 μg/ml。对照管阳性、TCH阳性或阴性、PNB阴性的菌株为结核分枝杆菌复合群，对照管阳性、TCH阳性、PNB阳性或阴性的菌株为非结核分枝杆菌。对照管阴性，即不生长，需要重做。(2)胶体金法定性检测培养阳性菌液中的结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64抗原。以上两种方法检测结果一致才纳入本研究的统计范围。

4.QFT-GIT检测方法：主要包括血液培养和酶联免疫法测定IFN-γ的水平两个步骤。

具体操作如下：抽取血液至3支QFT专用采血管(采血量要准确，采集后立即剧烈上下振摇10次，以确保整个试管内层都被血液覆盖)，将采血管以直立方式，于37 ℃培养16～24 h。培养结束后，采血管以(2000～3000)×g离心15 min，分离血细胞及血浆。从每支离心后的采血管取血浆用ELISA法进行IFN-γ的定量,以装有450 nm滤光片及620～650 nm参考滤光片的酶标仪来读取吸光度值(A值)。

结果判定标准：利用QFT-GIT专业分析判读软件，分析原始数据，报告检测结果。结果判读原理如表1所示。

质量控制：每次试验均测定标准品绘制标准曲线，并利用LIS分析标准曲线的相关系数和标准品测定值的准确度。若QFT-GIT阴性对照管的IFN-γ值高于8 IU/ml，如果不能排除技术上的差错和样本污染的可能，需要将该个体所有血浆样本都重测。

5.CD4+T淋巴细胞计数：实验操作按照美国BD公司FACS Calibur流式细胞仪说明书进行。CD4+T淋巴细胞计数单位：个/μl，本实验室参考值为414～1123个/μl。

三、统计学方法

用Microsoft Excel软件进行基础数据整理，采用SPSS 13.0分析软件进行统计学分析，各组阳性率比较采用卡方检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、 临床诊断和实验室检测情况

143例患者各种实验室检查阴性但又疑似结核病、临床诊断不明确者，不纳入本统计范围。1247例患者临床诊断和全血IGRA检测结果均已明确，其中肺结核患者792例，肺外结核131例，NTM肺病43例,HIV感染或AIDS患者并发肺结核98例,临床诊断其他疾病183例(含心血管系统疾病75例，呼吸系统疾病53例，肝胆系统疾病41例，泌尿系统疾病9例，结膜炎3例，肺癌2例)。50例患者临床诊断明确，全血IGRA检测结果为“不明确”。实验室检查结果显示：痰涂片和液体培养总阳性率为29.0%(376/1297)，其中涂片阳性共244例，阳性率为18.8%(244/1297)；液体培养阳性362例，阳性率为27.9%(362/1297)，经菌种鉴定结核分枝杆菌343例，占94.8%(343/362)；NTM 19例，占5.2%(19/362)；14例痰涂片阳性的肺结核患者液体培养为阴性。全血IGRA检测结果：833例患者检测为阳性,阳性率为64.2%(833/1297)；414例患者检测为阴性；50例患者(已剔除3例临床诊断不明确患者)检测为“不确定”，其痰涂片和液体培养均为阴性。

二、全血IGRA与痰涂片、液体培养的检测结果

肺结核、肺外结核、NTM肺病、HIV感染或AIDS患者并发肺结核、其他系统疾病5组患者痰涂片阳性率分别是28.5%(226/792)、5.3%(7/131)、11.6%(5/43)、6.1%(6/98)、0.0%(0/183)；痰液体培养阳性率分别是40.9%(324/792)、13.0%(17/131)、23.3%(10/43)、11.2%(11/98)、0.0%(0/183)；全血IGRA检测阳性率分别是77.0%(610/792)、80.9%(106/131)、27.9%(12/43)、50.0%(49/98)、30.6%(56/183)，见表2。全血IGRA与痰涂片相比，菌阴(涂阴和培阴)肺结核、肺外结核、HIV感染或AIDS患者并发肺结核各组阳性率差异有统计学意义(χ2值分别为373.52、152.51、46.73,P值均<0.01)，NTM肺病组差异无统计学意义(χ2=3.59,P>0.05)。全血IGRA与痰液体培养相比，肺结核、肺外结核、HIV感染或AIDS患者并发肺结核各组内检测阳性率差异有统计学意义(χ2值分别为212.03、121.38、34.68,P值均<0.01)，NTM肺病组差异无统计学意义(χ2=0.24,P>0.05)。在涂阳患者中，肺结核、肺外结核、NTM肺病和HIV感染或AIDS患者并发肺结核的全血IGRA检测阳性率分别为93.8%、100.0%、40.0%、66.7%；而在涂阴患者中，各组全血IGRA检测阳性率分别为70.3%、79.8%、26.3%、48.9%。

表1 QFT-GIT结果判读原理表

注 Nil表示空白对照管IFN-γ检测值；TB-Nil表示结核抗原管IFN-γ检测值减去空白对照管IFN-γ检测值；Mitogen-Nil表示促有丝分裂因子管IFN-γ检测值减去空白对照管IFN-γ检测值，单位均为“IU/ml”

三、全血IGRA检测结果与临床诊断结果的比较

临床诊断为肺结核、肺外结核的923例患者，痰涂片阳性233例，痰涂片检测结核病的敏感度为25.2%(233/923)，特异度为97.8%(221/226)；液体培养阳性为341例，液体培养检测结核病的敏感度为36.9%(341/923)，特异度为95.6%(216/226)；全血IGRA检测阳性716例，IGRA检测结核病的敏感度为77.6%(716/923)，特异度为69.9%(158/226)，见表3。比较痰涂片、液体培养、全血IGRA 3种方法对临床诊断结核病患者标本检测的敏感度和特异度，3种方法的敏感度差异有统计学意义(χ2=559.60,P<0.01)，3种方法的特异度差异有统计学意义(χ2=101.02,P<0.01)。

四、全血IGRA检测结果不确定患者CD4+T淋巴细胞计数结果

50例患者全血IGRA检测结果为“不确定”，占全部患者的3.9%(50/1297)，临床诊断26例为结核病(12例菌阴肺结核，5例菌阳肺结核，3例AIDS并发肺结核，2例结核性胸膜炎，2例颈部淋巴结结核，1例AIDS并发结核性胸膜炎，1例骨结核)，24例为非结核病(8例AIDS，6例肺炎，5例胸膜炎，3例胸腔积液，2例糖尿病；实验室和影像学检查均已排除结核病)。22例结核病患者全血CD4+T淋巴细胞计数结果低于参考值下限，占84.6%(22/26)，20例非结核病患者全血CD4+T淋巴细胞计数结果低于参考值下限，占83.3%(20/24)，两组比较差异无统计学意义(χ2=0.07,P>0.05)，统计全血IGRA检测结果“阳性”和“阴性”的患者外周血CD4+T淋巴细胞计数结果具体见表4。833例IGRA检测阳性患者中，25例CD4+T淋巴细胞计数低于参考值下限，占3.0%(25/833)；414例IGRA检测阴性患者中，28例CD4+T淋巴细胞计数低于参考值下限，占6.8%(28/414)，两组间差异有统计学意义(χ2=9.62,P<0.01)。IGRA不确定组CD4+T淋巴细胞计数分别与阳性、阴性组比较，差异均具有统计学意义(χ2=429.86,P<0.01；χ2=207.75,P<0.01)。

表2 不同组别患者的痰检与全血IGRA检测结果

表3 痰涂片、液体培养、全血IGRA检测结果与临床诊断结果的比较

注 结核病包括肺结核和肺外结核；非结核病包括NTM肺病和其他系统疾病

讨 论

QFT-GIT是一种体外诊断试验，它利用克隆早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)、培养滤液蛋白10(CFP-10)和TB7.7(P4)这3种蛋白的混合多肽刺激肝素化全血中的T淋巴细胞，再利用酶联免疫吸附法测定与多肽抗原体外反应所产生的γ-干扰素，从而判断受试者是否受到结核分枝杆菌的感染。该试验不能区分近期感染和既往感染，也不能区别结核潜伏感染和活动性结核病；当检测结果是阴性时表示可能没有感染但不能完全排除，尤其是当患者患有多种疾病而结核病只是其中一种时，又或者患者受免疫抑制限制，但发展成活动性结核病的可能性很大时。 QFT-GIT检测应用ESAT-6、CFP-10和TB7.7(P4)作为抗原，ESAT-6、CFP-10抗原的蛋白编码来源于结核分枝杆菌基因中的一个菌种特异性基因片段RD-1，而所有的BCG菌株和绝大多数NTM(堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌和苏尔加分枝杆菌除外)不含RD-1,因此该试验有着较高的特异度，且不受是否接种BCG的影响[6-7,13-14]。

本研究显示，全血IGRA对于肺结核、肺外结核、NTM肺病、HIV感染或AIDS并发肺结核的患者检测阳性率分别为77.0%(610/792)、80.9%(106/131)、27.9%(12/43)、50.0%(49/98)，均高于痰涂片和痰液体培养的阳性率[28.5%(226/792)、5.3%(7/131)、11.6%(5/43)、6.1%(6/98)和41.0%(325/792)、13.0%(17/131)、23.3%(10/43)、11.2%(11/98)]。全血IGRA分别与痰涂片、痰液体培养相比，肺结核、肺外结核、HIV感染或AIDS并发肺结核各组内阳性率差异有统计学意义(P值均<0.01)，NTM肺病组内差异无统计学意义(P值均>0.05)。由此可见，在肺结核、肺外结核、HIV感染或AIDS并发肺结核的诊断上，全血IGRA检测较痰涂片和培养有着更高的敏感度。在涂阳患者中，肺结核、肺外结核、NTM肺病和HIV感染或AIDS并发肺结核的全血IGRA检测阳性率分别为93.8%、100.0%、40.0%、66.7%；而在涂阴患者中，各组全血IGRA检测阳性率分别为70.3%、79.8%、26.3%、48.9%；此结果显示：肺结核和肺外结核患者选择全血IGRA辅助诊断结核病有着更高的价值，尤其对肺外结核和HIV感染或AIDS并发肺结核时更有意义。

表4 不同全血CD4+ T淋巴细胞计数结果在IGRA检测结果3类患者中的统计分析

注 表中括号内数值为“构成比(%)”

本研究中以临床诊断结核病为标准，全血IGRA对临床患者标本检测的敏感度为77.6%(716/923)，高于痰涂片、液体培养的敏感度(P<0.01)；全血IGRA检测的特异度为69.9%(158/226)，低于痰涂片、液体培养的特异度，差异有统计学意义(P<0.01)。国内外IGRA检测的敏感度为53%～98%，特异度为60%～90%,多篇文献报道的敏感度和特异度>70%[15-18]。本研究中IGRA特异度稍低，分析原因主要是：NTM肺病中27.9%(12/43)的患者呈阳性，其他系统疾病中30.6%(56/183)的患者呈阳性，两者较高的阳性率降低了IGRA特异度。前者呈现较高的阳性率与此类人群中可能有些受NTM和结核分枝杆菌的混合感染但临床上患者结核病表现不明显，或感染了与IGRA检测抗原相交叉的NTM，如海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌等有关；后者呈现较高的阳性率，主要原因与本中心收治患者病源种类有关，可能由于患者生活在结核病高度流行环境，已感染了结核分枝杆菌，但目前没有发病，临床和实验室无法判断已感染了结核分枝杆菌；或既往患结核病未痊愈。这些患者均为外院转诊或本中心收治的高度怀疑结核病但结核感染诊断依据不足者，虽然病历上临床诊断与结核感染不相关，但笔者认为此类患者考虑为结核潜伏性感染的可能性较大，应该继续追踪、关注这类患者，以证实是否患有结核病[15,19-20]。有文献报道证明，IGRA试验检测效率受结核分枝杆菌感染流行情况等影响，在低风险人群中检测的特异度较好,而在有潜在结核分枝杆菌感染的高危人群中检测的特异度明显降低[16,21-22]。

T淋巴细胞参与全血IGRA反应过程。效应T细胞是免疫应答的主要成分，CD4+T淋巴细胞在免疫反应中扮演重要角色，可以通过监测人体内CD4+T淋巴细胞数量来评估人体免疫功能。本研究中50例全血IGRA检测结果为“不确定”，占全部患者的3.9%(50/1297)，22例结核病患者全血CD4+T淋巴细胞计数结果低于参考值下限，占84.6%(22/26)，20例非结核病患者全血CD4+T淋巴细胞计数结果低于参考值下限，占83.3%(20/24)，两组间比较差异无统计学意义(χ2=0.07,P>0.05)。IGRA不确定组CD4+T淋巴细胞计数分别与阳性、阴性组比较，差异均具有统计学意义(χ2=429.86,P<0.01；χ2=207.75,P<0.01)。这说明IGRA“不确定”的结果与人体淋巴细胞数量低下、淋巴细胞活力降低、免疫功能受损、淋巴细胞产生IFN-γ不足等有关。当患者的免疫功能受到抑制或免疫系统功能欠佳，均有可能造成IGRA结果的不确定性。

许多研究表明，QFT-GIT优点较多：QFT-GIT试验设置了空白对照管和阳性对照管，以利于评价受试者的基础免疫状态和血样处理是否得当(阳性对照管)，及排除受试者体内嗜异性抗体效应和非特异的IFN-γ等影响(空白对照管)，从而提高了方法学的可靠性[17,23-25]。QFT-GIT试验属于体外试验，方便快捷，由专业软件判定结果，不受人为因素影响。QFT-GIT试验出现不确定结果，提示可能受试者免疫功能异常或血样处理、孵育过程不恰当[17,23-25]。QFT-GIT试验有着较高的敏感度和特异度，在检测过程中已对单个核细胞数量进行了标准化，基本可以消除淋巴细胞相对减少对检测结果的影响[16]，但本研究提示淋巴细胞严重减少对检测结果仍有干扰。因此，IGRA(QFT-GIT)在临床上可以作为结核病辅助诊断手段，尤其对肺外结核、涂阴肺结核，以及HIV感染或AIDS并发肺结核的患者有一定价值。但是QFT-GIT试剂盒价格较贵，对标本采集和处理的要求较高，结果不明确样本需重复检测，在一定程度上限制了其在临床诊断中的使用。

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(本文编辑：薛爱华)

The values of whole blood interferon-γ release assay in auxiliary diagnosis of tuberculosis

LITong-xin,HEYing,ZHOUGang,CHENDuan-duan,WEICheng-li,LIUMin,HUANGZhong-min,WANGJing,ZHONGMin,LUOMing,DINGXian-ping.

DepartmentofClinicalLaboratory,ChongqingPublicHealthMedicalCenter,Chongqing400036,China

LUOMing,Email:luoming1976@aliyun.com

Objective To evaluate the effects of whole blood interferon-γ release assay (IGRA) QuantiFERON@-TB Gold IT kit (QFT-GIT) in auxiliary diagnosis of tuberculosis. Methods A total 1440 patients from tuberculosis and Infection Departments of Chongqing Public Health Medical Center were collected and detected with sputum smear, Bactec960 and QFT from July 1,2014 to December 31,2015. The levels of IFN-γ of different groups of patients were analyzed by Chi-squareχ2test，P<0.05 was considered as statistically significant. Results The sensitivity and specificity of QFT were 77.6% (716/923) and 69.9% (158/226) when compared with clinical diagnosis. Compared with sputum smear (the positive rate 28.5% (226/792) in pulmonary tuberculosis, 5.3% (7/131) in extra-pulmonary tuberculosis and 6.1% (6/98) in HIV or AIDS/TB) and liquid culture (the positive rate 40.9% (324/792) in pulmonary tuberculosis, 13.0% (17/131) in extra-pulmonary tuberculosis and 11.2% (11/98) in HIV or AIDS/TB), IGRA showed higher positive rate (the positive rate 77.0% (610/792) in pulmonary tuberculosis, 80.9% (106/131) in extra-pulmonary tuberculosis and 50.0% (49/98) in HIV or AIDS/TB). The difference was significant statistically (χ2values 373.52,152.51 and 46.73 compared to sputum smear,χ2values 212.03, 121.38 and 34.68 compared to liquid culture,P<0.01). Conclusion IGRA is a rapid and simple tool for diagnosis of tuberculosis with high sensitivity especially for smear and culture negative, extra-pulmonary and HIV/AIDS combined tuberculosis.

Tuberculosis；Mycobacteriumtuberculosis； Enzyme-linked immunospot assay； Molecular diagnostic techniques； Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.08.005

重庆市卫生局2012年医学科研重点项目(2012-1-085)

400036 重庆市公共卫生医疗救治中心检验科(李同心、何瑛、周刚、陈耑耑、魏成丽、王静)，感染二科(刘敏)，病案室(黄忠民)，结核重点实验室(钟敏、罗明)；四川大学生命科学学院遗传医学研究所 特色生物资源研究与利用川渝共建重点实验室(丁显平)

罗明， Email: luoming1976@aliyun.com

2016-05-09)