高渗环境假丝酵母胞内甘油和海藻糖代谢研究

倪松，王聪，宋旭，高品，侯丽华（1．天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300461；．天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）



高渗环境假丝酵母胞内甘油和海藻糖代谢研究

倪松1，2，王聪2，宋旭1，*，高品2，侯丽华2
（1．天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300461；2．天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

摘要：研究高渗环境中假丝酵母（T酵母）细胞内海藻糖和甘油的代谢情况。利用微波破碎法这一传统的物理破壁法来提取T酵母细胞内甘油和海藻糖，并通过高效液相色谱仪测定细胞内甘油和海藻糖的含量。经过高效液相色谱测定，可以得到不同盐浓度下T酵母胞内甘油和海藻糖含量。T酵母在高渗环境中通过对甘油和海藻糖的积累，同时阻止甘油的外排作用来抵抗外界环境对其生长的影响。

关键词：假丝酵母；甘油；海藻糖；高效液相色谱

假丝酵母能在高渗透压环境中存活引起了人们关注[1]。在1976年，Brown提出了相容溶质可以在高渗透压环境中对细胞起到保护作用[2]。之后，Brown[3]和Crowe[4]报道了甘油和海藻糖对保护细胞内可溶性酶和细胞膜稳定性起作用。在Kuniho NaKata[5]和Sukesh[6]对酵母耐盐生长试验中，发现了酵母通过合成海藻糖来抵抗高渗环境。目前，国内主要研究鲁氏酵母（S酵母）的耐盐机理，很少研究T酵母[7]。本文将研究假丝酵母在高渗透压环境中细胞内海藻糖和甘油的代谢情况，为今后研究T酵母耐盐机理提供参考。

1　材料与设备

1.1菌株

酱油发酵过程中的耐盐产香酵母假丝酵母、米曲霉3.042来源于天津科技大学菌种保藏室。

1.2试剂

海藻糖为分析纯：北京索莱宝科技有限公司；甘油为分析纯：天津市天大化工实验厂；酵母提取物为分析纯：英国赛默飞世尔科技；乙腈为色谱纯：天津市科密欧化学试剂开发中心；氯化钠、蛋白胨、葡萄糖等试剂均为分析纯：天津市化学试剂一厂。

1.3仪器设备

LRH-250-A生化培养箱：广东省医疗器械厂；721型可见分光光度计：上海舜宇衡平科学仪器厂；冷冻离心机：Thermo Scientific，美国；微波炉：LG公司，韩国；微量进样器：Socorex，瑞士；高效液相色谱仪LC-20A型：岛津公司，日本。

1.4方法

1.4.1不同盐浓度条件下酵母生长曲线的测定

取培养到对数期的假丝酵母菌悬液，将其按初始5×106cfu/mL的浓度分别接入到200 mL的0 %、8 %、16 %盐浓度的YPDN培养基中，30℃，180r/min恒温培养。自接种时间起每隔12 h取一次样，用紫外可见分光光度计在600 nm处测其吸光值[8]。

1.4.2酵母胞内甘油和海藻糖的提取

将不同时间点取得的样品1 mL离心洗涤，取其中一管的假丝酵母菌菌体在80℃的烘箱中烘至恒重，计算每毫升发酵液中菌体的干重[9]。取另外一管的假丝酵母菌体利用微波破碎法[10]进行胞内甘油和海藻糖的提取。使用功率为700 W的微波炉进行破碎，每次微波处理时间为1min，时间间隔为30 s。然后加入1 mL的去离子水，涡旋1min。然后在冰浴条件下反复抽提3次，每次20min。抽提完毕后离心。吸取上清液过0.22 μm的微孔滤膜过滤，过滤完成后的抽提液即可用于测定酵母胞内甘油和海藻糖的含量。酵母胞内甘油和海藻糖含量是每克菌体中所含的二者的质量。

1.4.3甘油、海藻糖标准曲线的制作

分别准确称取甘油标品1.5 g，海藻糖标品1.0 g（精确至0.000 2 g），其中海藻糖在称量之前在60℃条件下干燥5 h。用70 %的乙腈溶液溶解甘油和海藻糖并最终定容到100 mL的容量瓶中。再以配制好的甘油和海藻糖标准液为基础，分别稀释成3、6、9、12、15 mg/mL的甘油标准液和2、4、6、8、10 mg/mL的海藻糖标准液。利用高效液相色谱检测标品中的标准品的含量，色谱柱为Inertsil氨基柱，5 μm，4.6 mm×300 mm。色谱柱柱温为30℃；流速为1.00 mL/min；检测器为示差检测器RID-10A；进样量为10 μ。

1.4.4样品中甘油、海藻糖含量的测定

色谱柱为Inertsil氨基柱，5 μm，4.6 mm×300 mm。色谱柱柱温为30℃；流速为1.00 mL/min；检测器为示差检测器RID-10A；进样量为10 μ[11-12]。流动相为70 %过膜后的乙腈。将不同时间点提取的胞内外甘油和海藻糖样品依次进样，并将得到的色谱图利用岛津工作站[13]进行数据分析，确定保留时间和相对应的峰面积。根据测得的峰面积代入到标准曲线求出样品中甘油和海藻糖的含量。

2　结果与讨论

2.1不同盐浓度条件下酵母生长情况

由于酵母进入高渗环境时会迅速产生相应的保护机制来适应环境的变化，因此为了确定酵母对环境适应的时间区段，有必要对其生长曲线进行测定确定酵母生长各个时期的时间区段。酵母的生长曲线见图1。

由图1可以清楚地看到酵母在12 h之后陆续进入对数期[14]，开始进行大规模的生长。在此之前酵母菌已经产生对环境的适应能力，因此选择在12 h之内选取时间点来对酵母的耐高渗能力进行研究。

图1　不同盐浓度条件下酵母生长曲线的测定Fig.1 The growth curve of T yeast under the different salt concentration

2.2酵母胞内甘油和海藻糖含量的测定

2.2.1甘油和海藻糖标准曲线的测定

甘油和海藻糖的标准曲线图见图2。

图2　（a）甘油的标准曲线；（b）海藻糖的标准曲线Fig.2（a）The glycerol standard curve；（b）The trehalose standard curve

利用高效液相色谱对假丝酵母胞内甘油含量进行测定，T酵母胞内甘油含量见图3。

由图3可以观察到0 %NaCl浓度下胞内甘油在第1小时时达到最高，然后在后面的4 h内下降达到最低点，在第5小时到第8小时胞内甘油含量开始上升，在第8小时后胞内甘油含量下降，到第11小时时胞内甘油含量趋于平稳。8 %NaCl浓度下第1小时胞内甘油含量比0 %第1小时降低61.5 %，在前6 h内胞内甘油含量一直降低，在第6小时到第8小时胞内甘油又逐渐升高，但都比另外两个盐浓度下含量低，此后下降，到第11小时时小幅度上升。16 %NaCl开始与0 %相同，但此后到第5小时在直线下降，第5小时到第8小时又在上升，但胞内甘油含量处于0 %和8 %之间。第8小时后逐渐下降，第11小时后趋于平稳。

图3　T酵母胞内甘油含量的测定Fig.3 The content of glycerol in the T yeast cell

2.2.3T酵母胞内海藻糖含量的测定

利用高效液相色谱对假丝酵母胞内海藻糖含量进行测定，T酵母胞内海藻糖含量见图4。

图4　T酵母胞内海藻糖含量的测定Fig.4 The content of trehalose in the T yeast cell

由图4可以观察到假丝酵母在0 %NaCl浓度下，胞内海藻糖在开始的6 h内波动并且下降趋势非常缓慢，在6 h后海藻糖含量直线下降。8 %NaCl浓度下胞内前6 h与0 %NaCl条件下波动类似，后6 h平缓下降但胞内海藻糖含量都比0 %时高。而16 %NaCl浓度下，胞内海藻糖含量在第2小时时达到峰值，在前4 h胞内海藻糖含量都比0 %、8 %NaCl浓度下的高，2 h后一直下降，第5小时降到最低，在第5小时到第7小时时胞内海藻糖的含量又逐渐升高，第8小时后海藻糖含量逐渐降低，但也都比另两个浓度下胞内海藻糖含量高。

3　结论

通过对不同盐度培养条件下酵母胞内甘油和海藻糖含量的测定发现，T酵母在12 h的时候进入指数生长期，说明酵母在12 h之内已经完成了对高渗环境的适应，而在此期间比较适合选作用来对T酵母的耐高渗环境进行研究。利用高效液相色谱法测定发现高渗透压会诱导细胞迅速产生大量的海藻糖和甘油，培养基中的渗透压越高，胞内海藻糖和甘油也越高[15]。T酵母在高渗环境中通过对甘油和海藻糖的积累，同时阻止甘油的外排作用来抵抗外界环境对其生长的影响。其中甘油的作用相对较小，而海藻糖在其耐高渗的过程中起着主要的作用。盐度越高，甘油的合成量越大。

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Metabolism of Glycerol and Trehalose in the Cells of Candida Versatilis in Hypertonic Environment

NI Song1，2，WANG Cong2，SONG Xu1，*，GAO Pin2，HOU Li-Hua2
（1.Animal，Plant and Foodstuffs Inspection Center，Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China；2.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：To study the metabolism of trehalose and glycerol in the cells of Candida Versatilis（T yeast）in the high osmotic environment.Using microwave crushing method the traditional physical wall breaking method to extract t yeast intracellular glycerol and trehalose，and by high performance liquid chromatography for the determination of the content of intracellular glycerol and trehalose.The contents of glycerol and trehalose in T yeast cells under different salt concentrations were determined by HPLC.The accumulation of glycerol and trehalose in the hypertonic environment of T yeast was also prevented by blocking the efflux of glycerol.

Key words：T yeast；glycerol；trehalose；HPLC

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.033

作者简介：倪松（1992—），男（汉），助理工程师，本科，研究方向：微生物检测和发酵。

*通信作者：宋旭（1990—），男（汉），助理工程师。

收稿日期：2015-09-01