桦褐孔菌发酵糙米混合物及产物活性成分分析

王艳梅，郭洪玲，王艳玲，王雅珍（黑龙江工业学院环境工程系，黑龙江鸡西158100）



桦褐孔菌发酵糙米混合物及产物活性成分分析

王艳梅，郭洪玲，王艳玲，王雅珍
（黑龙江工业学院环境工程系，黑龙江鸡西158100）

摘要：以糙米、玉米和红小豆组成混合物为基质，用桦褐孔菌固体发酵并对产物中总三萜、多酚和多糖进行测定。结果表明：玉米、红小豆和糙米等混合物经粉碎过10目筛后的基质发酵效果最好，总三萜和多酚含量分别达到最大值

6.27mg/g和22.48 mg/g，发酵效果好导致多糖消耗大，此时基质中多糖含量最低为10.57 mg/g；玉米相比糙米更能促进桦褐孔菌生长。

关键词：桦褐孔菌；固体发酵；发酵基质；活性成分

桦褐孔菌（Inonotus obliquu）是真菌门担子菌亚门多孔菌科一种药用真菌，主要分布北纬45°～50°的北欧、俄罗斯、日本及中国黑龙江省和吉林省[1]。自16世纪以来，东欧、俄罗斯等民间就广泛利用Chaga（白桦茸：桦褐孔菌中文学名）防治各种疑难杂症，如各种癌症（胃癌、肝癌、肠癌、各种消化器官的癌病）、心脏病、糖尿病[2]；现代药理学试验表明，桦褐孔菌具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等广泛的药理作用[3]。自20世纪80年代以来，随着对药用真菌多糖等活性物质研究的深入，真菌的营养学价值和药用价值越来越引起人们重视，正在成为医药工业和保健品工业的热门开发领域之一[4]。

三萜是桦褐孔菌主要化学组分，构成桦褐孔菌药效物质基础，桦褐孔菌总三萜含有量可直接影响其药效发挥；多酚类化合物是桦褐孔菌提取物抗氧化活性的主要成分；多糖是桦褐孔菌重要的活性成分之一，具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤及降血糖等多种生物活性[5]，本文研究以玉米、红小豆和糙米按不同配比组成混合物为基质固体发酵桦褐孔菌，测定发酵后基质中桦褐孔菌总三萜、总多酚、总多糖含量，为开发以桦褐孔菌为主要成分功能食品、药用饮料、食品添加剂等提供理论参考。

1　材料

玉米、红小豆、糙米：市售；琼脂：国药集团化学试剂有限公司。

桦褐孔菌醇标准品：河南大学药学院实验室提供；没食子酸、葡萄糖、钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、液溴等化学试剂均为分析纯。

YX280A灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；YT-CJ-1D超净工作台：北京亚泰科隆仪器有限公司；SPX-100B-Z恒温培养箱：上海博迅实业有限公司；YN3A3-9G电热鼓风干燥箱：吴江市亿能烘箱制造有限公司；722S分光光度计：上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂。

2　方法

2.1发酵菌种及固体发酵培养基制备

2.1.1发酵菌种制备

桦褐孔菌采自黑龙江大兴安岭林区白桦树干，经黑龙江工业学院老师鉴定。野生子实体用无菌水冲洗数次后用无菌纱布擦干，75 %酒精表面消毒后，用无菌解剖刀切开菌核，靠近菌核外壳附近取黄豆粒大小组织块于PDA斜面培养基（添加少量桦木屑），置30℃恒温培养箱中培养；待菌丝长满斜面时用接菌环从菌丝生长浓密的斜面培养基上取一环，划线接入琼脂平板中，28℃恒温培养箱活化培养14 d；取1 cm2溶于100 mL无菌水中，涡旋混匀，制得活化菌丝体匀浆液。

2.1.2固体发酵培养基制备

玉米、红小豆、糙米分别以质量比1∶1∶0（配方1）、1∶0∶1（配方2）、0∶1∶1（配方3）、1∶1∶1（配方4）混合成总质量100 g 4种不同基质，整粒或粉碎过10目或50目筛后装入灭菌袋100℃灭菌50min；冷却后每袋加入20 mL步骤2.1.1制得的菌丝体匀浆液，放入培养箱中28℃培养30 d；每种基质平行装2袋；发酵结束后，将基质置60℃干燥箱中烘干，粉碎，过60目筛备用。

2.2发酵后基质中活性成分提取及含量测定

2.2.1发酵后基质中总三萜提取及含量测定

桦褐孔菌醇是桦褐孔菌标志性成分，代表了其三萜类化合物共同结构母核及结构特点，因此以桦褐孔菌醇为标准品测定桦褐孔菌中总三萜含量[3]。

绘制桦褐孔菌醇标准曲线[3]：取适量真空干燥至恒重桦褐孔菌醇对照品，无水乙醇超声助溶配成0.3 mg/mL对照品溶液；准确量取0.3 mg/mL溶液用无水乙醇配成0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18 mg/mL标准溶液；准确量取不同质量浓度溶液1.0mL加入8%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL再加入60 %硫酸10 mL；50℃水浴加热20min，冷却后533 nm处测吸光度，结果在0.03 mg/mL～0.21 mg/mL（吸光度0.11～0.83）范围内，浓度与吸光度间线性关系良好，以吸光度值为纵坐标回归方程为y=3.392 9x+0.011 14，R2=0.999 3。

基质中总三萜提取：准确称取发酵后干燥粉碎的基质，加95 %乙醇25 mL回流提取3次，每次3 h，合并滤液至100 mL容量瓶中，用95 %乙醇定容，即得样品溶液，再参照绘制标准曲线方法测每个样品测吸光度3次取平均，通过标准曲线确定其含量。

2.2.2发酵基质后中总酚提取及含量测定

用Folin-Ciocaileu[6]法测发酵后基质中多酚含量，首先绘制标准曲线：准确称取真空干燥至恒重没食子酸10.0 mg，适量蒸馏水溶解，转入500 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀即得0.02 g/L没食子酸标准溶液。分别量取上述没食子酸标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，用蒸馏水稀释至10.0 mL后，得浓度为0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012 mg/mL，加2 mL 1 mol/L Folin-Ciocalteu显色剂，混匀后避光放置8min，再加7.5 mL 10 % Na2CO，混匀后室温避光反应60min，加蒸馏水稀释至30.0 mL，混匀后765 nm下测定其吸光度，以吸光度为纵坐标得回归方程为。

基质中多酚提取[7]：准确取发酵后干燥粉碎的基质，加20 mL 50 %乙醇按在50℃热水浴中回流提取3次，每次回流45min；合并3次滤液于500 mL容量瓶中，蒸馏水定容即得样品溶液，再参照绘制标准曲线方法测每个样品测吸光度3次取平均，再通过标准曲线确定其含量.

2.2.3发酵后基质中多糖提取及含量测定

用苯酚-硫酸法[8]测发酵后基质中多糖含量，首先绘制标准曲线：准确称量葡萄糖20 mg溶于500 mL容量瓶定容得浓度为0.04 mg/mL标准溶液。取葡萄糖标准溶液0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL置干燥试管中，分别以水补至4.0 mL，再分别加入6 %苯酚溶液1 mL摇匀，然后加10 mL浓硫酸充分摇匀室温放置20min，于490nm处测其吸光度，结果在0.008mg/mL～0.048mg/mL（吸光度0.16～0.89）范围内，浓度与吸光度间线性关系良好，回归方程为。

多糖提取参照文献[1]许泓瑜方法略作修改：准确取发酵后干燥粉碎的基质，加15 mL水、80℃热水浴浸提2.5 h，冷却后离心（4 000r/min）20min，取清液浓缩后加4倍体积95 %乙醇静置过夜，离心过滤得粗多糖；多糖粗提物加热蒸馏水复溶，加1/4体积Sevag溶液（氯仿∶正丁醇=4∶1）高速搅拌脱蛋白，糖液中再加入约4倍体积95 %乙醇，静置离心过滤，沉淀反复用丙酮洗，最后将沉淀物溶于水，定容于500 mL容量瓶中，再参照绘制标准曲线的方法测每个样品测吸光度3次取平均值，通过标准曲线确定其含量。

3　结果与分析

不同配方基质发酵后总三萜、总多酚、总多糖含量见表1。

表1　不同配方基质发酵后总三萜、多酚、多糖含量Table 1 The content of total triterpenoid，polyphenols and polysaccharides at different prescriptions

由表1可看出，玉米红、小豆和糙米等质量混合（配方4）粉碎过10目筛的基质发酵后总三萜和多酚含量都达到大值，分别为6.27、22.48 mg/g；玉米和糙米等质量混合（配方2）颗粒不经粉碎的基质发酵后多糖含量最高27.23 mg/g。

不同配方基质发酵后总三萜含量见图1。

图1　不同配方基质发酵后总三萜含量比较Fig.1 Comparison of content of total triterpenoid at different prescriptions

由图1可看出，不同组分基质对发酵影响很大；玉米、红小豆和糙米等质量混合（配方4），无论整粒还是粉碎，发酵后总三萜含量都高于其他配方相应组。原因可能糙米和玉米混合作为碳源与红小豆作为氮源适合桦褐孔菌成长所需C/N比；而配方2（玉米∶糙米=1∶1，不含红小豆）基质发酵后总三萜含量最低，说明发酵效果不好，可能是缺少红小豆作为氮源导致；对比配方1（红小豆与玉米等质量）和3（红小豆与糙米等质量）可看出玉米比糙米更能促进桦褐孔菌生长。

图2　不同配方基质发酵后总多酚含量比较Fig.2 Comparison of content of polyphenols at different prescriptions

由图2可以看出，配方4无论基质颗粒大小发酵后所含总多酚含量都高于其他配方相应组别，这一结果和原因与总三萜相似；配方3颗粒大小不同发酵后总多酚含量相差较大，说明发酵效果相对较好，但发酵后总多酚含量较低，可能是基质红小豆和糙米中多酚含量较低，导致发酵新产生的加上基质中原有的多酚总量仍然很低；配方2颗粒大小不同发酵后多酚含量相差不大，说明发酵效果相对较差，发酵新产生的多酚较少，而多酚含量相对较高可能是基质玉米和糙米中多酚含量较高。

图3　不同配方基质发酵后总多糖含量比较Fig.3 Comparison of content of polysaccharides at different prescriptions

对比图1与3可知，发酵效果较好的配方4，发酵后基质多糖含量很低，而发酵效果较差的配方2，发酵后基质多糖含量较高；配方1（红小豆与玉米等量混合）与3（红小豆与糙米等量混合）相比，玉米更有益于桦褐孔菌生长，所以发酵后基质多糖含量较低；同一配方也同样如此，基质粉粹过10目筛发酵效果较好而发酵后多糖含量相比整粒和过50目筛都低；说明发酵过程中消耗多糖大于菌体生长新产生产。

综上，对比图1、图2、图3可以看出，无论哪种配方，粉碎过10目筛基质发酵效果都优于整粒和过50目；说明基质颗粒大小对发酵影响很大，这与戚以政的结论是相符的，他认为固体发酵基质颗粒大小直接影响到单位体积颗粒所能提供的反应表面积的大小，也会影响到菌体是否容易进入基质颗粒的内部及氧的供给速率和代谢产物的移出速率等[9]。本实验整粒基质颗粒大，菌体不容易进入基质颗粒的内部，单位体积颗粒所提供的反应表面积小，不利于菌丝生长；另外孔隙过大，水分蒸发快，基质含水率降低，也不利于菌体生长。过20目筛的基质可能是颗粒间孔隙小，透气性差，O2供给速度及CO2排放速度都变慢，同时代谢产物的也不易移出，不利于菌丝体生长；另外驱除固体发酵代谢热主要依靠气体蒸发冷却，而基质颗粒小透气性差也导致基质局部温度高，而天然桦褐孔菌生长于寒冷环境，温度过高不利菌体生长。

4　优势与前景

问世于20世纪80年代末的“药用真菌新型（双向性）固体发酵”或称“双向发酵[10]”，其关键是采用有一定活性成分的中药材或药渣作为药性基质代替传统营养性基质与发酵菌种构成发酵组合[11]，药性基质在提供真菌所需营养同时，还受真菌生长分泌的酶的生物催化作用，将药性底物的活性成分进行修饰转化，并有可能产生新的药效成分，既提高了中药药效，又有新的活性成分产生，最终使单一发酵作用向双向性发展，“双向发酵”将成为研究开发中药新药的一条新途径[12]。将药用真菌双向固体发酵技术应用到功能性保健食品的研究开发上，即将药用或药食同用真菌接种于可食用杂粮谷物组成的固体基质上；由于发酵后菌丝体直接固定于基质，所以基质既含谷物杂粮丰富的营养成分，又含真菌代谢物等活性物质，因此有较高营养保健价值，直接对其进行加工制成适应市场需求的功能性菌质食品，一定具有良好的经济价值和非常广阔的应用前景。但同时探索最适宜桦褐孔菌固体发酵的条件及发酵后基质中有效成分种类和含量的变化都有待于进一步的研究。

参考文献：

[1]许泓瑜,孙军恩,陆震鸣．桦褐孔菌菌粉多糖提取工艺的优化[J]．食品与发酵工业,2008,11(4):175-178

[2]陈艳秋,李玉．桦褐孔菌的研究进展[J]．微生物学通报,2005,32(2): 124-127

[3]赵芬琴,赵辉,张生杰,等．桦褐孔菌总三萜的测定及不同提取方法的比较[J]．中成药,2012,34(5):888-891

[4] Wasser S P．Medicinal mushrooms as a source of antitumor and Immunomodulat-ing polysaccharides[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2002,60(3):258-274

[5]金光,杨恩月,金晴昊,等．桦褐孔菌多糖的抗肿瘤作用实验研究[J]．延边大学医学学报,2004,27(4):257-259

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[7]张梅梅,郑维发,赵艳霞,等．正交实验法优化桦褐孔菌多酚类物质的提取工艺研究[J]．菌物学报,2010,29(5):760-766

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[9]戚以政．影响固态发酵速率的因素及其动力学[J]．化学反应工程与工艺,1995,11(1):18-24

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[11]孙静,马琳,吕斯琦,等．中药发酵技术研究进展[J]．药物评价研究, 2011,34(1):49-52

[12]庄毅．中国药用真菌概况[J]．中国食用菌,2001,20(2):3-5

Studies on Inonotus Obliquus Fermented Brown Rice Mixture and Analysis of Active Ingredients of Fermentation Product

WANG Yan-mei，GUO Hong-ling，WANG Yan-ling，WANG Ya-zhen
（Department of Environmental Engineering，Heilongjiang University of Technology，Jixi 158100，Heilongjiang，China）

Abstract：A mixture sample comprised of Corn，Red adzuki bean，brown rice served as substrate.After Inonotus obliquus solid fermentation，the content of total triterpenoid，Polyphenols and polysaccharides were measured respectively.Results show that，substrate fermentation achieved the best results under the right conditions that Corn，Red adzuki bean and brown rice were mixed together by crushing，screening through mesh size of 10.The content of polysaccharides，Polyphenols reached maximum 6.27 mg/g and 22.48 mg/g respectively，but good fermentation effect resulted in high polysaccharides consumption.At this point，the content of polysaccharides of the substrate was the lowest，10.57 mg/g.Corn can improve the growth of Inonotus obliquus much more than brown rice.

Key words：Inonotus obliquus；solid fermentation；fermentation substrate；Active Ingredients

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.032

基金项目：2015年黑龙江省大学生创新创业训练计划指导项目（201511445007）

作者简介：王艳梅（1976—），教师，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

收稿日期：2015-10-09