ADAM17和Notch1在浸润性乳腺癌组织中的表达及意义

张艳，胡宝山，杨慧敏，孙影，张雪鹏

(1华北理工大学附属医院，河北唐山063000；2华北理工大学基础医学院)

ADAM17和Notch1在浸润性乳腺癌组织中的表达及意义

张艳1，胡宝山1，杨慧敏2，孙影2，张雪鹏1

(1华北理工大学附属医院，河北唐山063000；2华北理工大学基础医学院)

目的 探讨解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)、Notch1在浸润性乳腺癌发生、发展中的作用。方法 采用免疫组化法检测正常乳腺组织、乳腺纤维腺瘤组织及浸润性乳腺癌组织石蜡标本(均为30例份)ADAM17和Notch1染色指数及蛋白阳性表达率，分析二者的相关性及二者与浸润性乳腺癌患者临床病理特征的关系。采用Western blotting法检测新鲜冻存正常乳腺组织、乳腺纤维腺瘤组织及浸润性乳腺癌组织(均为10例份)ADAM17、Notch1蛋白相对表达量。结果 正常乳腺、乳腺纤维腺瘤、浸润性乳腺癌标本及组织中ADAM17、Notch1染色指数和蛋白相对表达量均依次升高(P<0.05或<0.01)。正常乳腺、乳腺纤维腺瘤及浸润性乳腺癌标本ADAM17蛋白阳性表达率分别为3.3%、10.0%、83.3%，Notch1蛋白阳性表达率分别为0、6.7%、76.7%；浸润性乳腺癌标本 ADAM17、Notch1阳性表达率均高于正常乳腺、乳腺纤维腺瘤标本(P均<0.05)。浸润性乳腺癌标本ADAM17和Notch1阳性表达率呈正相关(r=0.504，P<0.05)。浸润性乳腺癌标本ADAM17和Notch1蛋白阳性表达率均与患者的年龄、肿瘤直径无关(P均>0.05)，均与腋窝淋巴结转移有关(P<0.05或<0.01)。结论 浸润性乳腺癌组织中ADAM17和Notch1蛋白表达升高，其异常表达可能与肿瘤淋巴结转移有关。

浸润性乳腺癌；解聚素-金属蛋白酶17；Notch1

调控肿瘤生长的信号转导途径是个庞大而复杂的网络系统，涉及到多条通路之间的交互和整合。目前研究表明Notch信号通路是细胞间信息交流的重要通路，也是许多重要细胞信号转导通路的交汇点之一[1]。研究发现，解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)对Notch信号途径的激活和转录具有促进作用[2]。在Notch受体家族中，Notch1受体与肿瘤的关系最受人们关注，其介导的Notch1信号通路几乎与所有类型的恶性肿瘤有关。既往研究发现，ADAM17可促进乳腺癌细胞增殖、浸润和转移[3～5]，但ADAM17和Notch1在乳腺癌组织中的表达变化及其与患者临床病理特征的关系鲜见报道。为此我们进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2010年1月～2013年12月华北理工大学附属医院病理科保存的正常乳腺组织、乳腺纤维腺瘤组织及浸润性乳腺癌组织石蜡标本各30例份(分别简称为正常乳腺标本、乳腺纤维腺瘤标本及乳腺癌标本)，2013年6月～2014年12月华北理工大学附属医院于-70 ℃保存的新鲜正常乳腺组织、乳腺纤维腺瘤组织及浸润性乳腺癌组织各10例份(分别简称为正常乳腺组织、乳腺纤维腺瘤组织及乳腺癌组织)。采集标本者均为女性，具有完整的临床资料；浸润性乳腺癌患者均为首次发病，术前均未行放、化疗或其他抗肿瘤治疗，术后均经病理确诊。不同组织患者年龄具有可比性。

1.2 ADAM17和Notch1蛋白表达检测 ①正常乳腺标本、乳腺纤维腺瘤标本及乳腺癌标本ADAM17和Notch1蛋白检测采用免疫组化法。将不同组织石蜡切片经脱蜡、高压抗原修复后，3% H2O2室温浸泡30 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。血清封闭后滴加抗ADAM17、抗Notch1的一抗(1∶100稀释)，置于4 ℃ 冰箱过夜。次日PBS冲洗，滴加二抗，孵育30 min，PBS冲洗，滴加DAB显色液。用已知阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。ADAM17定位于细胞质，Notch1定位于细胞膜和细胞质。染色指数以染色强度评分与阳性细胞比例评分的乘积表示。染色强度评分：细胞无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞比例评分：阴性为0分，≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色指数>3定义为阳性，计算阳性表达率。分析浸润性乳腺癌组织ADAM17和Notch1蛋白阳性表达率的关系。②正常乳腺组织、乳腺纤维腺瘤组织及乳腺癌组织ADAM17和Notch1蛋白检测采用Western blotting法。将冻存的不同组织冰上解冻，经组织裂解液制成匀浆，提取细胞总蛋白。取50 μg蛋白100 ℃变性5 min，5%浓缩胶电泳后，转至醋酸纤维素(PVDF)膜。TBST漂洗PVDF膜3次，封闭液中孵育1 h，分别加入兔抗人ADAM17、兔抗人Notch1抗体(1∶1 000稀释)及GAPDH抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜。TBST冲洗，二抗室温震荡孵育1 h，TBST洗涤后，DAB显色。以GAPDH为参照，采用Image J图像分析系统分析PVDF中蛋白条带的灰度值，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值计算蛋白相对表达量。

1.3 乳腺癌标本ADAM17和Notch1蛋白表达与患者临床病理特征的关系 记录浸润性乳腺癌患者的年龄、肿瘤直径和腋窝淋巴结转移情况，分析其与乳腺癌标本ADAM17和Notch1蛋白表达的关系。

2 结果

2.1 ADAM17和Notch1蛋白表达情况 正常乳腺标本、乳腺纤维腺瘤标本及乳腺癌标本ADAM17染色指数分别为1.03±0.38、2.03±0.48、7.31±2.58，Notch1染色指数分别为0.59±0.20、2.38±0.53、6.41±1.88；三种标本中ADAM17和Notch1染色指数均依次升高(P<0.05或<0.01)。正常乳腺标本、乳腺纤维腺瘤标本及乳腺癌标本ADAM17蛋白阳性表达率分别为3.3%(1/30)、10.0%(3/30)、83.3%(25/30)，Notch1蛋白阳性表达率分别为0、6.7%(2/30)、76.7%(23/30)；乳腺癌标本ADAM17、Notch1阳性表达率均高于正常乳腺标本、乳腺纤维腺瘤标本(P<0.05)。乳腺癌标本ADAM17和Notch1双阴性表达率为10.0%(3/30)，双阳性表达率为70.0%(21/30)，二者阳性表达率呈正相关(r=0.504，P<0.05)。②正常乳腺组织、乳腺纤维腺瘤组织及乳腺癌组织ADAM17蛋白相对表达量分别为0.27±0.05、0.37±0.06、0.78±0.10，Notch1蛋白相对表达量分别为0.15±0.04、0.32±0.05、0.45±0.07；三种组织中ADAM17和Notch1蛋白相对表达量依次升高(P<0.05或<0.01)。

2.2 乳腺癌标本ADAM17和Notch1蛋白表达与患者临床病理特征的关系 乳腺癌标本ADAM17和Notch1蛋白阳性表达率均与患者的年龄、肿瘤直径无关(P均>0.05)，均与腋窝淋巴结转移有关(P<0.05或<0.01)。见表1。

表1 乳腺癌标本ADAM17和Notch1蛋白表达 与患者临床病理特征的关系

3 讨论

ADAM是一类具有多种生物学功能的细胞膜表面糖蛋白家族，也是锌离子依赖的金属蛋白酶家族，目前已经有40多个家族成员相继被发现。ADAM17是其中研究较广泛的重要成员之一，因其具有水解TNF-ɑ的作用又称TNF-ɑ转化酶[6]。ADAM17具有蛋白剪切酶样作用，通过剪切活化双调蛋白、转化生长因子、表皮生长因子等重要的受体配体，从而激活相应的信号转导通路，调节细胞的生物学活性[7]。ADAM17可通过不同的途径促进肿瘤细胞的侵袭和转移，正常状态下在哺乳动物的多种细胞中广泛表达，但表达量较少；而在多种恶性肿瘤组织中呈高表达状态，因此有一定的肿瘤特异性[7]。研究显示，卵巢癌、胃癌及胰腺癌组织ADAM17表达升高[8～10]；ADAM17在乳腺癌组织表达升高，与乳腺癌的恶性程度、临床分期和淋巴结转移密切相关[4，11,12]。特异性ADAM17小干扰RNA可以有效沉默ADAM17在乳腺癌细胞中的表达，使乳腺癌细胞的增殖能力明显下降[5]。

目前已在哺乳动物中发现4种Notch基因，分别命名为Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。Notch信号转导主要发生在细胞间，是介导细胞和细胞之间直接接触的信号通路之一，可以调控细胞的增殖、分化和凋亡。在Notch受体家族中，Notch1受体与肿瘤的关系最受关注，但活化形式不同的Notch1对肿瘤的调节作用不一致，且即使在同一种肿瘤，随着肿瘤发展阶段的不同，Notch1信号通路的作用也可不一致。Notch1在结肠癌组织中呈高表达，与肿瘤病理分型、病程和淋巴结转移呈正相关，提示Notch1在结肠癌的发生、发展中发挥重要作用[13]。研究显示，Notch1在非小细胞肺癌、胃癌及卵巢上皮性癌组织中表达明显升高[14～16]。

本研究免疫组化法和Western blotting法检测结果均显示，正常乳腺、乳腺纤维腺瘤及乳腺癌组织和标本中ADAM17、Notch1蛋白表达均依次升高；同时乳腺癌标本ADAM17、Notch1蛋白阳性表达率均与患者的年龄、肿瘤直径无关，与腋窝淋巴结转移有关。说明浸润性乳腺癌标本ADAM17、Notch1蛋白表达升高，提示患者预后不良。ADAM17与Notch1受体活化及随后的Notch1信号通路激活密切相关，ADAM17蛋白可通过激活Notch1受体引发Notch1信号通路的激活[17，18]。本研究中，乳腺癌标本ADAM17和Notch1双阴性表达率为10.0%，双阳性表达率为70.0%，二者阳性表达率呈显著正相关。证实了ADAM17蛋白可以促进Notch1信号途径的活化，但活化的ADAM17蛋白是通过水解Notch1受体配体、促进配体与受体的结合而启动Notch1信号途径，还是直接水解Notch1受体激活Notch1通路，仍需进一步研究。

综上所述，浸润性乳腺癌组织中 ADAM17和Notch1蛋白表达升高，其异常表达可能促进肿瘤淋巴结转移。

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河北省自然科学基金面上项目(C2010001767)；唐山市科学技术研究与发展计划项目(14130256B)。

张雪鹏(E-mail： syzxp@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.025

R737.9

B

1002-266X(2016)32-0071-03

2015-12-20)