神经生长因子对大鼠胫骨骨折愈合的影响及其机制

刘建军，黄亮，韩庆斌，李新志，阙祥勇

(三峡大学仁和医院，湖北宜昌443001)

·基础研究·

神经生长因子对大鼠胫骨骨折愈合的影响及其机制

刘建军，黄亮，韩庆斌，李新志，阙祥勇

(三峡大学仁和医院，湖北宜昌443001)

目的 观察神经生长因子(NGF)对大鼠胫骨骨折愈合的影响，并探讨其相关机制。方法 将60只胫骨骨折模型大鼠随机分为观察组和对照组，每组30只。观察组于造模后第2天开始肌注NGF 200 ng/kg，1次/d，连用2周。对照组以相同的方法肌注等量生理盐水。两组治疗后1周(T0)、2周(T1)、4周(T2)行胫骨X线检查，采用Perkins法计算骨痂体积；称量全长胫骨湿重，采用RT-PCR法检测骨痂组织胰岛素样生长因子-1(IGF-1)mRNA相对表达量。结果 随术后时间延长，两组骨痂体积及全长胫骨湿重均逐渐增加。两组T0、T1时间点骨痂体积及全长胫骨湿重比较均无统计学差异(P均>0.05)；观察组T2时间点骨痂体积及全长胫骨湿重明显高于对照组，T0、T1时间点骨痂组织IGF-1 mRNA相对表达量均明显高于对照组(P<0.05或<0.01)；两组T2时间点骨痂组织IGF-1 mRNA相对表达量比较无统计学差异(P均>0.05)。结论 NGF可促进大鼠胫骨骨折的愈合，可能与其促进骨折愈合过程中骨痂组织IGF-1表达有关。

胫骨骨折；骨折愈合；神经生长因子；胰岛素样生长因子-1；大鼠

神经生长因子(NGF)是一种神经营养因子，与一些细胞因子之间存在协同效应，对骨折愈合具有一定的促进作用，但是其作用机制尚不完全清楚[1，2]。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是由骨组织分泌的一种生长因子，对成骨细胞增殖和分化具有促进作用，既可作用于局部，又可作用于全身[3]。临床上关于NGF促进骨折愈合的机制是否与IGF-1有关尚不明确。2014年7～9月，我们对胫骨骨折大鼠给予NGF治疗，观察其对骨折愈合的影响，并探讨相关机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，10周龄，体质量(260±20)g，由三峡大学实验动物中心提供。试剂及仪器：注射用NGF购于厦门北大之路生物工程有限公司，RT-PCR试剂盒购于大连宝生物工程有限公司，总RNA分离试剂、DNA Marker购于天根生化科技(北京)有限公司，琼脂糖购于美国BIO-RAD公司；电子天平购于上海市第二天平仪器厂，PCR仪购于德国Biometra公司，凝胶成像分析系统购于美国Kodak公司。

1.2 胫骨骨折模型制备及分组处理 60只大鼠均建立胫骨骨折模型：5%水合氯醛腹腔注射麻醉。右后肢脱毛、消毒，于小腿中上1/3处行前正中切口，长约1.5 cm。切开皮肤、皮下组织及筋膜，扒开胫前肌，于胫骨结节下1.0 cm处横形切断胫骨。以1.0 mm克氏针经远端髓腔穿出，复位后逆行打入骨折近端。生理盐水冲洗，逐层关闭切口。术后肌注青霉素10万U，连用3天。将胫骨骨折模型大鼠随机分为观察组及对照组，每组30只。观察组于造模后第2天肌注NGF 200 ng/kg，注射部位为两侧腓肠肌，1次/d，连用2周。对照组以相同的方法肌注等量生理盐水。

1.3 相关指标观察

1.3.1 骨痂体积 治疗后1周(T0)、2周(T1)、4周(T2)，两组于麻醉状态下行胫骨X线检查，采用DR阅片的PACS系统测量骨半径、骨痂半径、骨痂长度(分别记为r1、r2、L，单位mm)，摄片和指标测量均由两位医生按照双盲原则进行操作。采用Perkins法计算骨痂体积，即V= 2πr1( r2-r1)L。

1.3.2 全长胫骨湿重 两组分别于T0、T1、T2时间点随机选取10只大鼠，麻醉状态下处死。取其全长胫骨，标本采集时注意保护骨折附近区域组织，以免破坏骨痂组织。去除内固定物，用天平称量全长胫骨湿重。

1.3.3 骨痂组织IGF-1 mRNA表达 采用RT-PCR法。各组称量胫骨全长湿重后，于骨折处上、下各2 mm取骨痂组织，液氮冻存。将骨痂组织研磨匀浆后，以TRIzol试剂一步法提取细胞总RNA，随后进行反转录。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，IGF-1上游引物：5′-CTTTGCGGGGCTGAGCT-3′，下游引物：5′-CTTCAGCGGAGCACAGT-3′，片段长度：184 bp；以GAPDH为内参，上游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC′，下游引物：5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，片段长度：196 bp。PCR扩增条件：94 ℃、5 min，94 ℃、45 s，54 ℃、45 s，72 ℃、45 s，72 ℃、6 min，共29个循环。采用凝胶成像分析系统检测条带的单位面积光密度值(OD值)，以真彩色医学图像分析软件(Image-proplus6.0)对结果进行半定量分析，以目的基因与内参基因OD值的比值计算mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 两组各时间点骨痂体积比较 随术后时间延长，两组骨痂体积均逐渐增大。两组T0、T1时间点骨痂体积比较无统计学差异(P均>0.05)，观察组T2时间点骨痂体积明显大于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组各时间点骨痂体积比较±s)

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05。

2.2 两组各时间点全长胫骨湿重比较 随术后时间延长，两组全长胫骨湿重均逐渐增加。两组T0、T1时间点全长胫骨湿重比较无统计学差异(P均>0.05)，观察组T2时间点全长胫骨湿重明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组各时间点全长胫骨湿重比较±s)

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05。

2.3 两组各时点骨痂组织IGF-1 mRNA相对表达量比较 观察组T0、T1时间点骨痂组织IGF-1 mRNA相对表达量均明显高于对照组(P<0.05或<0.01)，两组T2时间点骨痂组织IGF-1 mRNA相对表达量比较无统计学差异(P>0.05)。见表3。

表3 两组各时点骨痂组织IGF-1 mRNA 相对表达量比较±s)

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05，#P<0.01。

3 讨论

骨折愈合是一个复杂的骨再生过程，除了需要适当的生物力学环境外，多种组织、细胞及各种细胞因子之间的相互作用在骨折愈合过程中也发挥重要作用。随着高能量损伤和开放性损伤发生率的升高，骨折不愈合患者数量逐年增加。尽管众多新观念、新技术已经广泛应用于临床中，但目前骨折不愈合的治疗仍然面临着许多难题。

研究显示，合并中枢神经损伤的骨折患者愈合速度明显加快，骨痂生成也明显增多[4]。Bidner 等[5]研究认为，在机体的中枢神经受到损伤后，某些生长因子能够透过血脑屏障释放出来，作用于骨折局部而发挥作用。因此，以NGF为代表的神经营养因子在骨折愈合中的作用受到了广泛关注。NGF是最初发现能够促进神经细胞生长的一种因子，其作为治疗神经系统疾病的药物已经广泛应用于临床。随着研究的不断深入，NGF促进骨折愈合的作用也逐渐得到证实[6～9]。Grills等[10]研究发现，在骨折断端局部注射NGF后骨痂生成明显增多，骨痂刚度和抗折弯强度也显著增加。研究证实，NGF不仅可诱导神经纤维长入骨痂，还能刺激机体释放P物质、降钙素基因相关肽等神经肽类物质，而这些肽类物质能抑制骨吸收，促进成骨作用，对骨折的修复具有促进作用[11]。NGF能促进血管内皮细胞分化，加速毛细血管的形成，改善骨折处的血液供应；还可刺激骨细胞增殖分化，提高成骨细胞活性，是其促进骨折愈合的一条重要途径[11]。本研究结果显示，随术后时间延长，两组骨痂体积及全长胫骨湿重均逐渐增加，但观察组T2时间点骨痂体积及全长胫骨湿重明显高于对照组，说明NGF对大鼠胫骨骨折的愈合具有促进作用。

IGF-1是一种在骨细胞中含量丰富的生长因子，对成骨细胞功能具有重要的调节作用[12]，可增加成骨细胞和骨髓基质细胞的增殖和分化能力，减少骨胶原退化，增加骨质沉积；还能促进骨基质合成钙化，具有加速骨折愈合的作用[13]。本研究观察组T0、T1时间点骨痂组织IGF-1 mRNA相对表达量均明显高于对照组，说明NGF可能通过刺激 IGF-1的分泌而增强骨细胞的增殖分化，可能是NGF能够促进骨折愈合的重要机制之一。

综上所述，NGF对大鼠胫骨骨折的愈合具有促进作用，提高骨痂组织IGF-1表达有关可能是其作用机制。

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三峡大学青年基金资助项目(KJ2012A020)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.008

R687.3

A

1002-266X(2016)32-0027-03

2015-11-24)