大麻雨露脱胶真菌的分离及脱胶特性研究

杨庆丽(黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江大庆163319)



大麻雨露脱胶真菌的分离及脱胶特性研究

杨庆丽
(黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江大庆163319)

摘要:本研究从雨露沤麻后的大麻原茎上分离筛选大麻脱胶真菌。采用GB/T18147.2－2008和DNS法对6株优势真菌进行残胶率及脱胶酶活性分析。结果表明，DMJ6沤麻7 d，大麻原茎木质部及韧皮部分离较好且不破坏纤维完整性;残胶率明显低于其他;果胶酶、甘露聚糖酶活性高于其他，木聚糖酶活性较高，纤维素酶活性低于其他;此菌产酶快，4 d果胶酶及甘露聚糖酶活性可达100 U/mL。经18S rRNA鉴定，DMJ6与Asperigillus niger相似度为99%。

关键词:大麻;雨露脱胶;真菌;脱胶酶

大麻又称汉麻、花麻及线麻等，主要分布在亚洲及欧洲等地区［1］。我国有悠久的大麻种植历史，产量约占世界总产量的1/3，居世界首位［2］。大麻是重要的纤维作物，其纤维性能优异，具有卫生耐用、抗菌防臭、吸汗透气、防静电及防紫外线等功能，被广泛应用于服装、汽车、建筑等行业中，是一种环保型的纤维原料，有巨大的应用前景［3］。新鲜大麻茎需经过脱胶获得纤维后方可进行下一步加工，脱胶包括雨露沤麻和温水沤麻。其中雨露沤麻是指大麻收割后，平铺在地上自然环境下经过雨露浸润，一些微生物开始在麻茎上生长［4］。这些微生物均能产生降解大麻茎胶成分的酶，使韧皮部与木质部之间失去粘连而分开，从而释放大麻纤维。这些菌主要包括麦类黑变病菌、细交链孢菌、稻紫附球菌等［5］。但是，雨露沤麻耗时较长且天然接种的菌中有些菌能够产生大量纤维素酶，降低大麻纤维的质量，这在一定程度上影响了麻类产业的发展。本研究从雨露沤制后大麻原茎分离获得大麻脱胶菌，对其果胶酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶，纤维素酶活性进行研究，以获得能够快速降解甘露聚糖及果胶等大麻胶成分并对大麻纤维破坏较少的脱胶菌，为缩短雨露沤麻的周期提供帮助。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样品及试剂

实验所用材料品种为黑龙江省科学院大庆分院“火麻一号”。样本共15份分别采自黑龙江省科学院大庆分院肇州和克山大麻种植基地。

羧甲基纤维素钠( CMC) :天津市科密欧化学试剂有限公司;

果胶: Beijing kebio biotechnology.co.Ltd;

魔芋粉: Beijing kebio biotechnology.co.Ltd;

木聚糖:南京奥多福尼生物科技有限公司;

D－甘露糖: Sigma;

D－木糖: Sigma;

半乳糖醛酸: Sigma;

DNS试剂:自配;其它试剂均采用国产分析纯。

1.1.2培养基及培养条件

分离、纯化培养基为马铃薯葡萄糖培养基。

筛选培养基为大麻茎粉无机培养基( L) :大麻茎粉10 g，KH2PO41 g，( NH4)2SO45 g，KCl 0.5 g，CaCl20.2 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，pH 7.2［6］。

果胶培养基、去糖魔芋粉培养基、木聚糖培养基及CMC培养基为分别以5 g果胶、5 g去糖魔芋粉、5 g木聚糖及5 g CMC代替上述培养基中的大麻茎粉，其他无机成分相同。其中魔芋粉与75%乙醇按1∶5例混合浸泡15 h，重复三次后滤去乙醇65℃烘干即得去糖魔芋粉。

固体培养基中加入12 g琼脂，121℃灭菌30 min。

1.1.3试验仪器

台式高速冷冻离心机:上海天美科学仪器有限公司;紫外可见分光光度剂:上海精密仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1脱胶菌的分离纯化

雨露沤制后的大麻原茎经生理盐水冲洗后，用剪刀剪成1 cm左右小段，选取其中已有菌生长的加入到100 mL大麻茎粉无机培养基中，每瓶10段，28℃培养7 d后取培养液1 mL接种到新鲜的大麻茎粉无机培养基中，连续培养三代。三代后取上清1 mL接种到100 mL马铃薯葡萄糖培养基中，7 d为一个周期，连续传三代。之后采用稀释法涂布马铃薯葡萄糖培养基平板，7 d后根据菌丝形态及颜色的差异分别接种到马铃薯葡萄糖培养基平板上继续纯化培养，经多次纯化后将所得菌编号保藏到马铃薯葡萄糖培养基斜面中。

1.2.2脱胶能力分析

取未见菌生长的大麻茎，用剪刀切成10 cm左右的段，放入500 mL三角瓶中，每瓶20根，覆上封口膜后灭菌。将上述实验中分离的优势菌种用马铃薯葡萄糖液体培养基活化后各取1 mL，分别与30 mL灭菌蒸馏水充分混合，接种到上述装有大麻原茎段的三角瓶中，摇晃三角瓶使菌接种到大麻茎上。每种菌设三个重复，以仅加入灭菌蒸馏水为空白对照。28℃沤麻7 d后感观法及GB/ T18147.2－2008残胶率测定法分析5种菌的脱胶性能。

感观评分法:取脱胶后的大麻原茎段5根100℃烘干3 h，根据韧皮与木质部的分离程度进行评分，共4个等级;空白对照记0分，部分分离记1分，基本分离记2分，分离良好记3分。评分人员为随机选择。

1.2.3酶活测定

取以上述优势菌分别接种到100 mL果胶、去糖魔芋粉、木聚糖及CMC含量为1%的三种培养基中28℃培养7 d，每种设三个重复，重复三次培养后取培养液10 mL，4℃9000 r/min离心30 min，取上清获得粗酶液。

DNS法测果胶酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶活性，分别以半乳糖醛酸、D－甘露糖、D－木糖、葡萄糖绘制标准曲线。酶活力单位定义为:在酶最适条件下，每分钟水解底物产生1μg半乳糖醛酸( D－甘露糖、D－木糖、葡萄糖)所需的酶量，以U/mL表示［7－8］，即:

其中U－酶活力单位( U/mL)

G－酶解液中还原糖含量(μg)

N－酶液稀释倍数

V－加酶液量( mL)

t－酶解时间( min)

取上述实验获得的脱胶能力最好的1株真菌分别接种到100 mL果胶、去糖魔芋粉、木聚糖及CMC含量为1%的三种培养基中，每种设三个重复。28℃培养7 d后重复一次，之后再分别接种到250 mL上述培养基中。每天取10 mL培养液测酶活，方法同上。

1.2.4菌种鉴定

由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.5作图及数据分析

Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism5软件作图和数据分析。

2　结果与分析

2.1脱胶菌的分离纯化

从沤制后的大麻原茎中共分离出15株真菌，其中优势菌6株。根据其菌落颜色、形态、边缘整齐度等的不同分别命名为DMJ1－6(见图1)。

图1　大麻茎中分离的优势真菌Fig.1 Dominant fungi isolated from hemp stem

2.2优势菌株脱胶能力分析

由表1、图2可见，雨露沤麻7 d后空白对照表皮无真菌生长，韧皮部与木质部几乎不分离。实验组6株真菌均可在大麻茎上生长。DMJ1，DMJ3组大麻纤维完整性较好，但韧皮部与木质部分离程度低，大麻原茎残胶率与空白对照组无显著差异( P＞0.05)。DMJ2组麻茎韧皮部与木质部极易分离，麻茎残胶率极显著低于空白对照组( P＜0.01)，但纤维完整度几乎完全被破坏。DMJ4，DMJ5组韧皮部与木质部较易分离，大麻茎残胶率与空白对照组相比差异显著( P＜0.05)，DMJ4组纤维完整度较差。DMJ6组麻茎韧皮部与木质部极易分离，纤维完整度好，麻茎残胶率极显著低于空白对照组( P＜0.01)。

表1　优势菌脱胶能力分析Tab.1 Degumming capacity of dominant fungi

图2　脱胶7 d大麻韧皮分离情况Fig.2 Separation degree of hemp bast after 7 d degumming

2.3脱胶酶活性分析

2.3.1优势菌株7 d大麻脱胶酶活分析

图3　优势菌7 d脱胶酶活性Fig.3 Hemp degumming enzyme activities of dominant fungi after 7 d

2.3.2大麻脱胶菌7 d脱胶酶活变化情况低活性且变化不大( P＞0.05)，木聚糖酶活性0～4 d处于稳定状态( P＞0.05)，之后极显著升高( P＜0.01)。表明DMJ6菌株能够在较短时间内发挥脱菌功能，且对大麻纤维损伤较小，具有实用价值。

2.3.3菌种鉴定

经18S rRNA菌种鉴定，大麻脱胶菌DMJ6与Asperigillus niger.相似率达到99%。

图4　DJM 6脱胶酶活变化Fig.4 Change of DMJ6 hemp degumming enzyme activities

3　讨论

大麻是一种具有广阔发展空间与市场前景的作物。与亚麻和苎麻相比其胶质含量较高，有些高达40%以上，脱胶难度较大［9］。脱胶效果对于后续生产及产品质量有很大的影响。传统大麻脱胶多采用碱煮为核心的化学脱胶法，这种方法的缺点是出麻率低，环境污染严重［10］。大麻雨露脱胶对环境破坏小，在经济发达、劳动成本高、环保要求严格的国家被广泛采用［11］。目前雨露脱胶多为微生物天然接菌，沤麻周期较长，根据雨量及气温的不同需要3～5周的时间。因此，人们想到采用人工方法将大麻脱胶菌接种到大麻茎上以缩短沤麻周期。目前分离出的麻类脱胶菌包括Clostridium，Bacillus，Aspergillus，Penicillium，Cladosporium等，应用范围几乎包括所有麻类［12］。

大麻脱胶就是将原茎中的果胶、半纤维素，木质素等成分分解使韧皮部与木质部分离，从而释放大麻纤维。其中半纤维素主要为甘露聚糖和木聚糖。因此高效大麻脱胶菌应具有高果胶酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、木质素酶活性及低纤维素酶活性。近年来，许多科学家对大麻脱胶菌及上述几种酶的产生菌进行了研究。如汪学军分离出的大麻脱胶放线菌及彭源德的脱胶细菌［11－12］，相对此两株菌DMJ6与大麻雨露脱胶时产生黑色霉点之后完成脱胶更为接近，且对条件要求不高，有利于在田间大面积应用。王军等分离了一株产果胶酶菌株HY11，在苎麻发酵培养基中，果胶酶活性可达335 U/mL［13］。李用芳等人从土壤中分离到一株产木聚糖酶黑曲霉，6 d摇瓶培养酶活可达到656.8 U/g［14］。张晓燕的研究表明，黑曲霉以麸皮为碳源固态发酵，72 h甘露聚糖酶活为82.44 U/g［15］。王茂成的研究中真菌泰灵芝木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶，漆酶的活性分别为121.6、108.7，516.2 U/g。比较而言，本研究中获得的大麻雨露脱胶真菌Asperigillus niger DMJ6培养7 d，果胶酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶活性不高，分别为175.06、146.73、101.73 U/mL。此菌能较好分离大麻木质部与韧皮部原因可能与大麻胶成分复杂需要多种酶协同作用有关。另外，木质素降解与脱胶效果直接相关，DMJ6产木质素酶研究将作为本课题组下一阶段工作的重点。

参考文献:

［1］汪学军，闵长莉，殷智超.一株具有脱胶功能大麻内生真菌的分离和鉴定［J］.西北植物学报，2014，34( 3) : 0623－0627.

［2］ALARU M，KUKK L，OLT J，et al.Lignin content and briquette quality of different fibre hemp plant types and energy sunflower［J］.Field Crops Research，2011，124( 3) : 332－339.

［3］ARNAUD L，GOURLAY E.Experimental study of parameters influencing mechanical properties of hemp concretes［J］．Construction and Building Materials，2012，28( 1) : 50－56.

［4］郭恒翠.雨露沤麻在云南昭通的发展前景［J］.吉林农业，2012，12( 274) : 20－21.

［5］毕蕾，季英超，姜凤琴.大麻雨露沤制技术研究［J］.中国麻业科学，2007，29( 1) : 28－31.

［6］董政娥，丁若垚，郑磊，等.亚麻粗纱碱性脱胶菌株的筛选鉴定及脱胶效果［J］.印染助剂，2013，30( 10) : 16－19.

［7］黄小龙.南方亚麻微生物脱胶技术及其机理研究［D］.长沙:湖南农业大学硕士学位论文，2004.

［8］丁若垚.亚麻粗纱脱胶微生物的选育与应用［D］.上海:东华大学博士学位论文，2013.

［9］李志刚.汉麻纤维的超声波/双氧水脱胶工艺研究［J］.印染助剂，2014，31( 9) : 39－42.

［10］王贵宾.大麻脱胶功能菌株的选育及在沤麻中的应用［D］.哈尔滨:黑龙江大学硕士学位论文，2009.

［11］彭源德，唐守伟，杨喜爱，等.大麻快速脱胶菌株的选育与脱胶性能鉴定［J］.纺织学报，2007，28( 12) : 65－68.

［12］汪学军，闵长莉，杨艳，等.大麻微生物脱胶特异放线菌菌株的筛选与鉴定［J］.纺织学报，2014，35( 11) : 102－106.

［13］王军，黄秀琴，王杰，等.一株高产果胶酶菌的分离及其产酶条件的优化研究［J］.安徽农业科学，2009，37( 36) : 17902－17904.

［14］李用芳，李学梅，张建新，等.木聚糖酶产生菌的选育及发酵条件研究［J］.生物技术，2004，14( 1) : 25－27.

［15］张晓燕.黑曲霉固态发酵制备β－甘露聚糖酶及其分离纯化［D］.南京:南京农业大学硕士学位论文，2014.

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Study on Isolation of Hemp Dew－retting Fungi and the Enzyme Activities

YANG Qingli
( Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences，Daqing 163319，Heilongjiang，China)

Abstract:Hemp dew－retting fungi was isolated from the stem of hemp in present study.GB/ T18147.2－2008 and DNS methods were used to research the separation degree of hemp bast and xylem，gum content and degummase activities of hemp by 6 dominant fungi.Results showed DMJ6 separated the hemp fiber and kept its completion.Gum content and cellulase activity of DMJ6 were the lowest，but pectinase and mannanase activities were the highest in 6 dominant fungi after 7 d degumming.Pectinase and cellulase activities of DMJ6 could reach 100 U/mL after 4 d．The relative similarity of DMJ6 and Asperigillus niger was 99% according to 18S rRNA test．

Keywords:hemp;dew－retting;fungi;degumming enzyme

作者简介:杨庆丽( 1977－)，女，助理研究员，研究领域为微生物。E－mail: qingliqingli@126.com。

基金项目:黑龙江省应用技术研究与开发计划“大麻原茎雨露脱胶新工艺的研究”( GC13B209)

收稿日期:2015－10－08

文章编号:1671－3532( 2016) 01－0024－06

中图分类号:S563.3

文献标识码:A