原位预处理甘蔗糖蜜对耐高温酿酒酵母突变株Saccharomyces cerevisiae AQ生产乙醇的影响*



原位预处理甘蔗糖蜜对耐高温酿酒酵母突变株Saccharomyces cerevisiae AQ生产乙醇的影响*

0引言

【研究意义】在当今世界能源紧缺的情况下，不仅筛选耐高温、产乙醇性能好的酿酒酵母菌株是必要的，还需要开发能加快乙醇发酵速率、缩短生产周期、提高乙醇收率等特点的绿色工艺。【前人研究进展】糖蜜是蔗糖生产的副产物，在我国广西、云南和广东等主要蔗糖产区已经成为生物乙醇的主要生产原料[1]。酿酒酵母是糖蜜乙醇生产的主要出发菌株，最佳培养温度多在25～35℃，这使得在目前的酿酒酵母乙醇发酵生产中往往需要加入冷却工序[2-3]。若既能保证乙醇产量，又能将发酵温度提高至38～40℃，将可以极大地节省能源，并在我国夏季高温季节仍能进行正常的乙醇发酵[4]。另一方面，糖蜜成分复杂且黏度高，培养基中的高浓度糖蜜会减弱发酵过程的传质和传热作用，从而抑制微生物菌株正常的生理代谢，降低细胞活力，导致乙醇产量偏低[5-7]。对糖蜜进行脱毒预处理，可以去除或降低其中对微生物生长产生抑制作用的有害物质，从而增加目标产品的生产效率[8-10]。【本研究切入点】现有预处理工艺需要对糖蜜原料进行稀释、加热、强酸/碱处理，工艺过程复杂且易产生环境污染。微生物细胞在预处理前后糖蜜中的生理特性差异也鲜有报道。因此，有必要探讨和分析原位预处理糖蜜促进酿酒酵母生长和乙醇生产的原因，开发一条绿色、低成本糖蜜乙醇生产途径。【拟解决的关键问题】以从窖泥中筛选的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae A及其突变株Saccharomyces cerevisiae AQ为出发菌株，考察在不同温度和初糖浓度条件下，两株菌的生长和乙醇生产性能差异，再以原位预处理前后糖蜜为发酵底物，测定突变株Saccharomyces cerevisiae AQ在不同培养基中的生长量、出芽率、乙醇产量，并通过细胞内与呼吸作用相关酶的活力，即胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶、细胞质内ATP酶和线粒体内ATP酶活力的变化,从机理上分析原位预处理对菌株生长和发酵过程的促进作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1甘蔗糖蜜

甘蔗糖蜜购于广西南宁，含水分23.52%、总糖43.50%(其中葡萄糖3.69%、果糖8.91%、蔗糖30.90%)、灰分7.21%、总氮1.34%、胶体15.92%，其他8.51%。

甘蔗糖蜜原料在常温下的黏度为10.3 Pa·s。经复合表面活性剂/氨水二元复合体系[11]预处理后，在常温下的黏度降低至2.3 Pa·s。

1.1.2菌株

Saccharomyces cerevisiae A为野生型酿酒酵母，从江苏汤沟两相和酒业有限公司窖泥中筛选获得，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC AY 2015007。将Saccharomyces cerevisiae A进行紫外诱变，筛选得到最优突变株Saccharomyces cerevisiae AQ，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC AY 2015008。

1.1.3培养基

酵母菌种子培养基(YPD培养基，W/V)：1% 酵母膏，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，自然pH值；在115℃条件下灭菌15 min；固体培养基添加2.5%琼脂。

发酵培养基(W/V)：总糖20%(以糖蜜或葡萄糖为唯一碳源)，蛋白胨2%，磷酸氢二铵0.05%，尿素0.05%，磷酸氢二钾0.02%，硫酸镁0.02%，pH值为6.0。发酵培养基在121℃条件下灭菌20 min。

1.2方法

1.2.1种子培养

挑取保存在斜面培养基的菌种到YPD液体培养基中，装液量为50 mL/500 mL三角瓶，37℃、200 r/min培养至对数生长中后期，作为种子液备用。

1.2.2发酵培养

种子液以10%(V/V)的接种量添加至发酵培养基中，发酵培养基初始pH值为6.0,培养基装液量为150 mL/500 mL三角瓶，30～37℃，200 r/min发酵36 h，再静置发酵至终点。

1.2.2.1温度对乙醇发酵的影响

以糖蜜原料为发酵培养基中的唯一碳源，初始总糖浓度为100 g/L，发酵温度分别为30℃、37℃和42℃，测定发酵34 h后Saccharomyces cerevisiae A和Saccharomyces cerevisiae AQ的菌体生长量(OD600)和出芽率，以及发酵液中的乙醇浓度，考察温度对两株酿酒酵母的生长及乙醇发酵的影响。

1.2.2.2初始糖浓度对乙醇发酵的影响

以糖蜜原料为发酵培养基中的唯一碳源，发酵温度为37℃，初始糖浓度分别为100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L和300 g/L，测定发酵34 h后Saccharomyces cerevisiae A和Saccharomyces cerevisiae AQ的菌体生长量(OD600)和出芽率，以及发酵液中的乙醇浓度，考察初始糖浓度对两株酿酒酵母的生长及乙醇发酵的影响。

1.2.2.3预处理糖蜜对乙醇发酵及胞内呼吸作用相关酶活力的影响

根据上述实验结果选取最优的发酵菌株，分别以葡萄糖、糖蜜原料、预处理糖蜜为发酵培养基的唯一碳源，初始总糖浓度为200 g/L，发酵温度为37℃，每隔4～8 h取样测定发酵液中的乙醇浓度，以及酿酒酵母菌体生长量(OD600)、胞内SOD活力、胞内过氧化物酶、细胞质内ATP酶和线粒体ATP酶活力，考察预处理对发酵菌株乙醇生产、菌体生长及胞内呼吸作用相关酶活力的影响。

1.2.3分析

用生物传感仪(SBA-40C型，山东微生物研究所)测定发酵液中乙醇浓度。

用紫外分光光度计(752s型，上海棱光技术有限公司)测定发酵液中酿酒酵母OD600。用血球计数板测定发酵过程中的酿酒酵母菌体数目并计算细胞出芽率。

酿酒酵母蛋白含量测定使用BCA(Bicinchoninic Acid)蛋白定量试剂盒，购自Sigma-Aldrich；胞内SOD活力的测定使用SOD活力分析试剂盒，购自BioVision。试剂盒的使用均按说明书进行。胞内过氧化物酶和ATP酶活力分别按照惠永华等[12]和Korshunov 等[13]报道的方法进行，其中线粒体的提取方法按张凤莲[14]报道的方法操作。

2结果与分析

2.1温度对乙醇发酵的影响

在温度分别为30℃，37℃和42℃时发酵34 h后，原始菌株Saccharomyces cerevisiae A的OD600分别为13.15，11.64和7.16，菌株生长量随着发酵温度的升高而降低；而突变株Saccharomyces cerevisiae AQ的OD600分别为13.75，13.12和10.66，当发酵温度在30～37℃时，菌体生长量无显著变化，当温度升高至42℃时，生长量降低22.47%(图1a)。两株酿酒酵母在出芽率和乙醇生产上也出现类似的情况：Saccharomyces cerevisiae A的发酵温度从30℃提高至37℃时，出芽率为20.92%，降低了13.99%(图1b)，乙醇生产量为4.07%，降低了15.99%(图1c)，当温度提高至42℃时，出芽率和发酵液中乙醇浓度仅分别为15.33%和2.55%；而突变株Saccharomyces cerevisiae AQ的发酵温度从30℃提高至37℃时，出芽率和乙醇生产量无显著变化，将温度进一步提高至42℃时，出芽率和发酵液中乙醇浓度才分别降低至19.22%和4.13%(图1b、图1c)。说明相对于原始菌株Saccharomyces cerevisiae A，突变株Saccharomyces cerevisiae AQ在30～37℃的发酵温度下具备更好的生长量和乙醇生产稳定性。

2.2初始糖浓度对乙醇发酵的影响

从图2可以看出，当初始糖浓度为100 g/L时，两株酿酒酵母的OD600、出芽率和发酵液乙醇浓度都无明显差别，而当初始糖浓度进一步增加时，原始菌株Saccharomyces cerevisiae A的生长和乙醇生产受到明显抑制。突变株Saccharomyces cerevisiae AQ在初始糖浓度为200 g/L时获得最高的OD600、出芽率和乙醇浓度，分别为16.88，9.62%和6.84%。此条件下得到的乙醇收率为22.80%，而葡萄糖生产乙醇的理论收率为51.1%，故该条件下糖蜜原料生产乙醇的收率仅为理论收率的44.62%。

■:Saccharomyces cerevisiae A；□:Saccharomyces cerevisiae AQ

图1温度对菌株生长和乙醇生产的影响

Fig.1The effect of temperature on cell growth and ethanol production of Saccharomyces cerevisiae

结合2.1节的分析可知，突变株Saccharomyces cerevisiae AQ较原始菌株Saccharomyces cerevisiae A更适用于糖蜜发酵乙醇体系，因此选取突变株Saccharomyces cerevisiae AQ进行后续研究。

—□—:Saccharomyces cerevisiae A；

—△—:Saccharomyces cerevisiae AQ

图2初始糖浓度对菌株生长和乙醇生产的影响

Fig.2The effect of initial sugar concentration on cell growth and ethanol production of Saccharomyces cerevisiae

2.3预处理对乙醇发酵的影响

由图3可知，Saccharomyces cerevisiae AQ在葡萄糖培养基中的生长速度最快，发酵34 h后OD600达到26.66，发酵液中的乙醇浓度为12.14%，表明葡萄糖仍是Saccharomyces cerevisiae AQ生长和乙醇生产的最佳碳源。Saccharomyces cerevisiae AQ在糖蜜原料培养基中发酵48 h的OD600仅有16.80，发酵液中的乙醇浓度仅为6.84%。而将预处理糖蜜作为唯一碳源时，发酵43 h的OD600为20.98，比糖蜜原料获得的OD600值高24.88%；发酵液中乙醇浓度为9.32%，乙醇收率为31.07%，该收率为理论收率的60.80%，较糖蜜原料培养时提高36.26%。

2.4预处理对胞内呼吸作用相关酶活力的影响

如图4所示，Saccharomyces cerevisiae AQ分别在以葡萄糖、糖蜜原料和预处理糖蜜为唯一碳源的培养基中发酵34 h后，其细胞内SOD酶活力分别为10.45 U/mg蛋白、2.18 U/mg蛋白和7.66 U/mg蛋白；胞内过氧化物酶活力分别为0.36 U/mg蛋白、0.12 U/mg蛋白和0.23 U/mg蛋白；细胞质内ATP酶活力分别为0.26 U/mg蛋白、0.05 U/mg蛋白和0.14 U/mg蛋白，线粒体内ATP酶活力分别为0.42 U/mg蛋白、0.11 U/mg蛋白和0.27 U/mg蛋白。以预处理糖蜜作为唯一碳源，Saccharomyces cerevisiae AQ的胞内SOD酶活力、胞内过氧化物酶活力、细胞质和线粒体内获得的ATP酶活力较以糖蜜原料为唯一碳源时分别增加2.51倍、1.92倍、1.80倍和1.45倍。

—□—:葡萄糖Glucose；—△—:甘蔗糖蜜原料Molasses material；—◇—:预处理甘蔗糖蜜Pretreated molasses

图3预处理对生长和乙醇生产的影响

Fig.3The effect of pretreatment on cell growth and ethanol production of Saccharomyces cerevisiae

图4预处理对菌株胞内酶活力的影响

Fig.4The effect of pretreatment on intracellular enzyme activity of Saccharomyces cerevisiae

3讨论

筛选糖蜜乙醇生产性能良好的菌株，以及绿色简便的糖蜜预处理方法是提高糖蜜乙醇生产的关键技术。本研究以广西产甘蔗糖蜜为原料，探讨原位预处理方法对酿酒酵母高温发酵糖蜜乙醇的促进作用，以及在以原位预处理前后的甘蔗糖蜜为唯一碳源的培养基中，酿酒酵母突变株Saccharomyces cerevisiae AQ的生理特性变化。研究表明，突变株Saccharomyces cerevisiae AQ在37℃条件下仍能保持良好的糖蜜乙醇发酵能力。原位预处理方法将糖蜜黏度降低了77.67%，以该预处理糖蜜作为Saccharomyces cerevisiae AQ发酵过程的唯一碳源，乙醇收率为31.07%，较糖蜜原料提高36.26%。相对于其他糖蜜预处理方法而言，原位预处理同样可以极大地促进菌体生长和乙醇生产，还具有工艺简便、成本低、对环境友好等优点。

在前人的研究中发现，细胞内SOD、过氧化物酶，以及ATP酶活力与酿酒酵母在受到高盐、高浓度乙醇、高糖等胁迫时的菌体活力呈正相关[15]。本研究中当以原位预处理糖蜜作为Saccharomyces cerevisiae AQ唯一碳源时，胞内SOD酶、过氧化物酶、细胞质内ATP酶和线粒体内ATP酶活力也较以糖蜜原料为唯一碳源时分别增加2.51倍，0.92倍，1.80倍和1.45倍，说明经原位预处理获得甘蔗糖蜜可通过增强Saccharomyces cerevisiae AQ在糖蜜培养基中的呼吸作用，提高菌株活力，从而进一步提高乙醇收率。但原位预处理前后，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae AQ糖蜜乙醇生产过程中胞内产物、胞内酶活力的变化机理还需深入考察。

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(责任编辑：陆雁)

Promoting Ethanol Production of Cane Molasses by a Mutant Thermophilic Strain Saccharomyces cerevisiae AQ Using an in situ Pretreatment Method

何珣1，蒋学剑2**，花加伟1，陈可泉1***，柏建新1

HE Xun1，JIANG Xuejian2，HUA Jiawei1，CHEN Kequan1，BO Jianxin1

(1.南京工业大学生物与制药工程学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏南京211816；2.江苏汤沟两相和酒业有限公司，江苏连云港222535)

(1.State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical，Nanjing Tech University，Nanjing，Jiangsu，211816，China；2.Tanggou Liangxianghe Wine Pty Ltd.，Lianyungang，Jiangsu，222535，China)

摘要：【目的】探讨和分析原位预处理糖蜜促进酿酒酵母生长和乙醇生产的原因，开发一条绿色、低成本糖蜜乙醇生产途径。【方法】先在不同温度和初始糖浓度条件下，考察酿酒酵母原始菌株Saccharomyces cerevisiae A及其突变株Saccharomyces cerevisiae AQ的生长和乙醇生产性能差异，再以原位预处理前后糖蜜为发酵底物，测定突变株Saccharomyces cerevisiae AQ在不同培养基中的生长量、出芽率、乙醇产量、胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶、细胞质内ATP酶和线粒体内ATP酶活力，研究原位预处理糖蜜对其生理特性的影响。【结果】在高温发酵糖蜜过程中，突变株Saccharomyces cerevisiae AQ较原始菌株Saccharomyces cerevisiae A表现出更好的生长和乙醇发酵稳定性。当以原位预处理糖蜜作为Saccharomyces cerevisiae AQ唯一碳源时，其胞内SOD酶、过氧化物酶、细胞质内ATP酶和线粒体内ATP酶活力较以糖蜜原料为唯一碳源时分别提高2.51倍，0.92倍，1.80倍和1.45倍，乙醇收率为31.07%，较以糖蜜原料为唯一碳源时提高36.26%。【结论】突变株Saccharomyces cerevisiae AQ较原始菌株Saccharomyces cerevisiae A更适用于糖蜜发酵生产乙醇体系，且新型的原位预处理方法能通过增强Saccharomyces cerevisiae AQ在糖蜜培养基中的呼吸作用，提高菌株活力，从而进一步提高乙醇收率。

关键词：原位预处理糖蜜酿酒酵母乙醇

Abstract：【Objective】The positive effects of the in situ pretreated molasses on Saccharomyces cerevisiae cell growth and ethanol production were explored and analyzed in order to develop a green and low cost pathway of ethanol production from molasses.【Methods】First, the differences of growth and ethanol production performance were compared between the original strain Saccharomyces cerevisiae A and the mutant strains Saccharomyces cerevisiae AQ;then both un-treated and in situ pretreated molasses were used as fermentation substrate,in which different parameters of the mutant strain Saccharomyces cerevisiae AQ were measured,including the cell growth,budding rate,ethanol production,and the activity of intracellular superoxide dismutase (SOD),peroxidase,ATP enzyme in the cytoplasm and the mitochondria,to investigate the effects of the in situ pretreatment molasses on the physiological characteristics of Saccharomyces cerevisiae AQ.【Results】During the fermentation process of molasses under high temperature condition,the mutant strain Saccharomyces cerevisiae AQ presented better stability in cell growth and ethanol yield than its original strain Saccharomyces cerevisiae A.When the in situ pretreated molasses was used as the single carbon source of Saccharomyces cerevisiae AQ,the activities of intracellular SOD enzyme,peroxidase,ATP enzyme in the cytoplasm and ATP enzyme in the mitochondria increased by 2.51,0.92,1.80,and 1.45 times, respectively,than that obtained in raw molasses material medium.The obtained ethanol yield from pretreated molasses was 31.07%,which was 36.26% higher than the ethanol yield obtained from molasses raw material.【Conclusion】The mutant strain Saccharomyces cerevisiae AQ was more suitable for molasses ethanol fermentation system than its original strain Saccharomyces cerevisiae A,and the new in situ pretreatment method could further increase ethanol yield through enhancing Saccharomyces cerevisiae AQ respiration and cell vitality in molasses mediums.

Key words:in situ pretreatment，molasses，Saccharomyces cerevisiae，ethanol

中图分类号：TQ922.9

文献标识码：A

文章编号：1005-9164(2016)01-0001-06

作者简介：何珣(1983-)，女，实验师，主要从事废弃生物质资源化和能源化研究。

收稿日期：2016-02-16

*国家“863”项目(2015AA021005)和广西科学研究与技术开发计划项目(桂科重1598004-4)资助。

**共同第一作者：蒋学剑(1984-)，男，工程师，主要从事白酒生产工艺研究。

***通讯作者：陈可泉(1982-)，男，副研究员，硕士生导师，主要从事生物技术及酶催化研究，E-mail:kqchen@njtech.edu.cn。

广西科学Guangxi Sciences 2016,23(1):1～6

网络优先数字出版时间：2016-03-15

网络优先数字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1510.006.html