水溶性蝇蛆 甲壳素的提取及红外光谱分析

李小波，褚夫江，沈娟，金小宝

（1.广东省生物活性药物研究重点实验室，广东广州510006；2.广东药科大学基础学院，广东广州510006）

水溶性蝇蛆 甲壳素的提取及红外光谱分析

李小波1，2，褚夫江1，2，沈娟1，金小宝1，2

（1.广东省生物活性药物研究重点实验室，广东广州510006；2.广东药科大学基础学院，广东广州510006）

甲壳素是药用昆虫蝇蛆的生物活性成分之一，本研究采用酸碱法并辅以微波加热提取蝇蛆甲壳素，继而以碱冻融法制备低脱乙酰度的水溶性甲壳素。FTIR光谱分析结果表明，2种样品均具有3个典型的甲壳素酰胺谱带特征吸收峰，分别为1 653cm-1和1 621cm-1（Ⅰ）、1 555cm-1（Ⅱ）、1 309cm-1（Ⅲ）（蝇蛆甲壳素初提物），以及1 625cm-1（Ⅰ）、1 524cm-1（Ⅱ）和1 305cm-1（Ⅲ）（水溶性蝇蛆甲壳素）。家蝇蛆水溶性甲壳素的制备有助于拓展其深加式利用。

蝇蛆；水溶性甲壳素；傅里叶红外光谱

作为一类重要的资源昆虫，蝇类幼虫（蝇蛆）含有丰富的蛋白质、脂肪、多糖、矿物质等营养物质，可广泛应用于食品和动物饲料开发。此外，蝇蛆还含有甲壳素、溶菌酶、抗菌肽、凝集素等具有药用价值的生物活性物质，在医药领域也有着广泛的应用前景[1]。例如，传统中药五谷虫即为家蝇、大头金蝇及其近缘蝇类昆虫的干燥幼虫，其功效主要为清热解毒，消积导滞；主治毒痢作吐、小儿疳积腹胀、疳疮、唇疔、褥疮和深脓疱等。五谷虫（蝇蛆）在《本草蒙筌》《本草纲目》《本草备要》等明清时期药学著作及《中药志》《中国动物药志》等现代中药著作中均有收记，在我国历史上有文献记载的应用延续至今已有400余年的历史。

在蝇蛆的活性成分中，甲壳素是一种天然高分子多糖化合物，甲壳素、壳聚糖（甲壳素的N-脱乙酰基产物）及其衍生物具有增强免疫，调节肠道功能，降低动物体胆固醇，抑制或杀灭多种病原体、抗氧化等生物活性，在医药卫生方面可用作抗肿瘤剂、抗高血压药、抗微生物剂、伤口敷料、药物载体和抗溃疡药物等[2，3]。但是，由于分子间强烈的氢键作用，甲壳素不溶于水及常见稀酸、稀碱和有机溶剂，限制了其在医药工业中的应用。本研究拟从家蝇蛆中提取甲壳素并进一步制备成水溶性甲壳素，以期为拓展蝇蛆中生物活性物质资源的深层次开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

家蝇蛆壳；氢氧化钠（NaOH）、盐酸（HCl）、双氧水（H2O2）和丙酮（CH3COCH3）等为国产化学纯或分析纯试剂；微波炉、电热恒温干燥箱、酸碱滴定管等为国产仪器；BRUKER TENSOR Ⅱ傅里叶红外光谱仪（德国），用于测定红外光谱。

1.2 蝇蛆甲壳素的提取

采用酸碱法并辅以微波加热提取甲壳素。

1.2.1 脱钙

称取蝇蛆壳50g，磨碎后浸滞于250mL 10%HCl溶液并搅拌混匀，把装有蛆壳-盐酸混合物的玻璃烧杯置于微波炉中，中火加热30min，其间取出烧杯搅拌混匀两三次，加热完毕后冷却至室温，用去离子水重复洗涤沉淀物，直至洗出液的pH=7。

1.2.2 脱蛋白

上述沉淀与250mL 10%NaOH溶液在玻璃烧杯中混合均匀后，同上置于微波炉中加热并洗涤。

1.2.3 脱色

将上述经稀碱液处理后的沉淀悬浮于50mL 10%H2O2中，置于微波炉，中火加热10min，冷却后用水洗涤至pH=7，所得漂白产物即为甲壳素初提物，50℃过夜烘干。

1.3 水溶性甲壳素的制备

以上述漂白产物按文献[4]所述方法制备水溶性蝇蛆甲壳素，简述如下：称取2g甲壳素初提物，在冰浴条件下与40g 48%NaOH溶液搅拌混匀，于-20℃冰冻浸滞过夜，制得溶胀的碱化甲壳素。在冰浴中，向上述溶胀的碱化甲壳素中加入86g碎冰，搅拌，形成清澈的胶状溶液。将该胶状溶液在4℃条件下搁置10d（每天搅拌混匀一次），加入4mol/L HCl调节pH值至7.5～8.0。煮沸溶液30min，直至形成溶胀的胶状物，离心，得到的沉淀以去离子水洗涤至中性。以10倍体积的水悬浮沉淀，加入2mol/L HCl调节pH值至6.0～6.5，直到悬浮液变得澄清，然后用纱布过滤。在滤液中加入丙酮，直至白色纤维状沉淀不再增加，沉淀以90%丙酮溶液洗涤3次，置于60℃电热恒温干燥箱烘干。

1.4 脱乙酰度测定

采用酸碱滴定法，按照文献[5]所述方法进行。准确称取0.5g水溶性甲壳素样品，置于250mL三角瓶中，加入标准0.1mol/L HCl标准溶液30mL，搅拌至溶解完全，加入五六滴甲基橙-苯胺蓝指示剂，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定游离的HCl至溶液变成浅蓝绿色。另取1份水溶性甲壳素样品，置于105℃烘干至恒重，测定水分。按文献[5]所列公式计算脱乙酰基度。重复试验3次。

1.5 红外光谱鉴定

采用BRUKER TENSOR Ⅱ傅里叶红外光谱仪测定干燥样品的红外光谱（FTIR），配备Diamond ATR（金刚石晶体衰减全反射附件）和DTGS（Deuterated Triglycine Sulfate，氘化三甘氨酸硫酸酯）检测器。测量时把样品放置于金刚石晶体上。试验参数为：波长扫描范围4 000～400cm-1，光谱分辨率4cm-1，扫描次数32。

2 结果与分析

2.1 蝇蛆甲壳素和水溶性甲壳素的制备及脱乙酰度测定

采用酸碱法并辅以微波加热提取的甲壳素初提物为不溶于水的白色颗粒，以该初提物经浓碱液碱化、冻融处理后制得了水溶性甲壳素。制备的水溶性甲壳素在丙酮中为白色纤维状沉淀，烘干后为淡黄色颗粒状固体，可在去离子水中浸渍过夜而溶解，采用酸碱滴定法测得其脱乙酰度为29.43%±0.85%。

本试验采用了能高效催化和促进化学反应的微波加热法辅助提取蝇蛆甲壳素。与传统的加热方式不同，微波加热可使溶剂中极性分子的取向随微波场而变化，导致分子发生各种形式的运动而形成位移电流和碰撞，从而产生摩擦并最终产生大量的热，使材料温度升高，其优点是受热均匀、升温速度快。在化学工业中，微波的这种加热特性有助于提高反应速度和化学产率[6，7]。本研究应用酸碱法并辅以微波加热提取甲壳素，缩短了酸或碱处理时间，3～4 h内就完成了以传统酸碱法长时间浸泡处理（需要2～3 d）的过程，大大缩短了操作时间。

甲壳素分子内和分子间有强烈的氢键作用，不溶于水、低浓度的酸及常见的有机溶剂，仅溶于浓盐酸、浓硫酸等，这在一定程度上限制了甲壳素的应用。一般认为，脱乙酰度是影响甲壳素溶解性能的重要因素，当甲壳素的脱乙酰度小于50%时不能溶于水和常见的稀酸[8]，但也有研究把甲壳素经过一定处理后制得脱乙酰度更低的水溶性甲壳素（20%～30%）[9]。本研究以浓碱液处理甲壳素后再在低温条件下和碱反应制备了低脱乙酰度的水溶性甲壳素，可在室温或者冰浴条件下在水中浸滞过夜而溶解，扩展了甲壳素的应用范围。

2.2 蝇蛆甲壳素及水溶性甲壳素的FITR光谱特征

采用BRUKER TENSOR Ⅱ傅里叶红外光谱仪记录的蝇蛆甲壳素及水溶性甲壳素的红外光谱（FTIR）分别见图1、2，其主要谱带和归属见表1。

图1 蝇蛆甲壳素初提物的FTIR光谱图

图2 水溶性甲壳素的FTIR光谱图

2种样品均具有3个典型的酰胺谱带（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）形成的吸收峰，通过Bruker标准谱库检索，鉴定为甲壳素。对比2种制备样品的FTIR谱图：蝇蛆甲壳素初提物分别在1 653cm-1和1 621cm-1左右各有1个酰胺Ⅰ谱带吸收峰，为NH2面内弯曲振动峰，可判定其为α-甲壳素[6，8，10-15]；而水溶性甲壳素仅在1 625cm-1左右有一个酰胺Ⅰ谱带吸收峰，和文献中的β-甲壳素的吸收峰单峰在1 655～1 660cm-1不同[6，12-14，16]，因此难以准确地判断其分子晶体结构类型，这可能是在水溶性甲壳素的制备过程中，浓碱液冻融处理破坏了甲壳素分子内与分子间氢键，从而进一步对其分子晶体结构有较大破坏[8]，这种结晶状态的变化也可能导致其物理性质如溶解性等发生变化。

表1 2种甲壳素的FTIR主要谱带波数

甲壳素初提物的酰胺Ⅱ谱带吸收峰出现在1 555cm-1，与文献报道的α-甲壳素（1 556cm-1）相近[6，8，10-14]；值得注意的是，水溶性甲壳素的酰胺Ⅱ谱带吸收峰出现在1 524cm-1左右，其酰胺Ⅱ谱带吸收峰向低波数偏移，也说明甲壳素初提物分子间的氢键作用强烈，而水溶性甲壳素分子中氢键较甲壳素少，且氢键较弱，缔合不明显[17]。2种样品的酰胺Ⅲ谱带吸收峰出现位置较近，分别为1 309cm-1和1 305cm-1左右，均和文献中报道的α-型甲壳素的酰胺Ⅲ谱带吸收峰相近[6，8，10-13]。

甲壳素初提物在1 113cm-1左右有一个不对称面内环伸缩振动形成的吸收峰，和已有研究[8，11-13，16]相似，而水溶性甲壳素无此吸收峰。此外，甲壳素初提物在3 428cm-1和3 256cm-1左右均有一吸收峰，为O-H伸缩振动和N-H伸缩振动重叠形成的多重吸收峰，分别与多糖残基上的羟基和氨基（或未脱去的乙酰氨基）对应，这些羟基和氨基存在分子内和分子间氢键，且具有α-型甲壳素晶体结构特征。水溶性甲壳素仅在3 334cm-1附近形成一个较宽的吸收峰，可能是由N-H振动峰形成，与β-甲壳素相近，这也从另外一个角度表明水溶性甲壳素分子内和分子间的氢键较甲壳素样品弱[18，19]。

3 结论

采用酸碱法并辅以微波加热提取了家蝇蛆甲壳素初提物，并进一步制备成水溶性甲壳素。经FTIR图谱分析鉴定，2种制备样品均为甲壳素，但水溶性甲壳素的酰胺Ⅰ和Ⅱ谱带吸收峰均向低波数发生了偏移，导致其分子晶体结构和氢键发生变化，影响其溶解性能。

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The Preparation of Water-Soluble Chitin from Fly Maggot and FTIR Analysis

Li Xiao-bo1,2,Chu Fu-jiang1,2,Shen Juan1,Jin Xiao-bao1,2
(1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances,Guangdong Guangzhou 510006;2.School of Basic Courses,Guangdong Pharmaceutical University,Guangdong Guangzhou 510006)

Chitin is one of the bioactive components of medicinal insect maggots.In this study,fly maggot chitin was extracted by acid-alkali method,assisted by microwave heating,and water-soluble chitin with low deacetylation degree was further prepared by alkali-freezing-thawing treatment.FTIR spectral analysis results showed that the two samples had three typical absorption peaks of amide bands of chitin in both samples:1 653 cm-1&1 621 cm-1(Ⅰ),1 555cm-1(Ⅱ) and 1 309 cm-1(Ⅲ),for initial extraction of maggot chitin;1 625 cm-1(Ⅰ),1 524 cm-1(Ⅱ),1 305 cm-1(Ⅲ),for further preparation of water-soluble chitin,respectively.The preparation of water-soluble chitin can be beneficial for the deep development and utilization of medicinal maggots.

Fly-maggot;Water soluble chitin;FTIR

TQ041+.7

A

2096-0387（2016）06-0004-04

2015年广东省医学科学技术研究基金项目（No.A2015040）。

李小波（1974-），男，博士，讲师，研究方向：昆虫生物活性物质研究。