金黄色葡萄球菌鉴定及spa基因多态性分析

曾德兴杨 慧黄丽雯



金黄色葡萄球菌鉴定及spa基因多态性分析

曾德兴1杨 慧2黄丽雯3

【摘要】目的 鉴定分离自龙岗区的金黄色葡萄球菌，探讨使用金黄色葡萄球菌spa基因对菌株进行多态性分析的价值。方法 在GenBank数据库中查找金黄色葡萄球菌spa基因序列，并设计引物进行实时荧光PCR技术分型，建立新的金黄色葡萄球菌分型方法，并与常规金黄色葡萄球菌spa基因分型和脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型法进行比较，构建龙岗区金黄色葡萄球菌分型数据库。结果 5例患者抗结核治疗前后前鼻腔定植的金黄色葡萄球菌spa分型相同，结果与PFGE结果一致；5例患者定植的金黄色葡萄球菌spa分型分别为：t795、t179、t189、t758和t796，其中t795、t758和t796为新发现的分型。结论 spa分型是一个较好的金黄色葡萄球菌快速基因分型方法。

【关键词】葡萄球菌；SPA；基因

1龙岗区坂田街道预防保健所，广东深圳 518129

2龙岗区疾病预防控制中心，广东深圳 518129

3龙岗区龙岗街道预防保健所，广东深圳 518129

金黄色葡萄球菌又称为嗜肉菌，是人类较重要的病原菌。由于金黄色葡萄球菌可导致院内感染，进而影响患者的身体健康，故亟需对其进行快速及准确分型，以减少院内感染的发生。Kumari等[1]采用脉冲场凝胶电泳对其进行分型，但是该方法的操作步骤较复杂，且所使用的设备较昂贵，难以在实验室中普及，限制了其应用。基因多态性方法与脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型法相比，具有较好的稳定性及重复性，且快速易用，容易得到实验结果，以满足实验室的实验要求[2]，然而目前国内鲜有相关报道。本研究就基于金黄色葡萄球菌spa基因的多态性进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 选取来源于临床、食物中毒及食品监测处的金黄色葡萄球菌菌株10株，其中5株来源于结核病患者的鼻拭子，3株来源于食品，1株来源于食物中毒，1株来源于腹泻标本。

1.2 检测方法

1.2.1 spa基因分型 将各菌株置于胰酶大豆琼脂平板接种，并过夜培养，将5个典型的菌落置于普通裂解液中；然后加入溶葡萄球菌素和RNA酶，使终浓度为100 μg/ml，煮沸10 min，以1000 r/min离心10 min（离心半径为8.7 cm），将上清液作为PCR模板。根据文献设计PCR扩增spaX区的引物：PCR反应条件：95℃预变性；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃45 s，共30个循环；然后72℃延伸10 min，4℃保护，并在紫外光灯下观察并记录PCR产物。spa分型采用GenBank数据库（http://www.ridom.de/spaserver/），测序结果中所使用的重复编码判度根据相关文献获得[3]。

1.2.2 PFGE ①将菌悬液与等量低熔点琼脂糖混匀，并制作成块；②待蛋白酶K过夜消化后，其染色体DNA的原位消化则采用Sma Ⅰ内切酶；③使用脉冲电泳仪，型号为CHEF-Mapper，根据美国疾病控制和预防中心（CDC）TENOVER等方法判定结果。

2 结果

2.1 治疗前spa基因扩增产物结果 5例患者治疗前分离的菌株A和治疗后分离的菌株B的spa基因扩增产物长度分别相同。

2.2 spa基因分型结果 结果可见，spa基因重复序列数为6～10个。菌株1A和1B、2A和2B、3A和3B、4A和4B、5A和5B具有相同的重复序列。分型结果为：2A和2B为t179型，3A和3B为t189型；1A和1B、4A和4B、5A和5B的spa型为新发现的基因型，根据相关数据库的数据分别定为t795、t758 和t796型。见表1。

表1　5例患者治疗前后的spa重复编码特征、重复数长度及分型

2.3 PFGE结果 由表1可见，1A与1B的条带相同，以此类推，2A、3A、4A、5A分别与2B、3B、4B、5B的条带相同。5例患者治疗前后所分离菌株类型是相同的，但所携带菌株的类型则不同。

3 讨论

金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病的重要致病菌，其暴发流行严重威胁着人类健康。减少和控制金黄色葡萄球菌感染的一个重要策略是明确流行环节，切断传播途径，因此，如何选择可靠的分型方法，对于院内感染的控制有重要作用，但目前使用的各种金黄色葡萄球菌分型方法各有缺点。高分辨率熔解曲线（HRM）技术是在实时荧光PCR基础上发展起来的一种新的实时定量新技术，是目前最好的一种高通量突变扫描和基因分型技术，具有操作简便、快速、低成本、灵敏度及特异度高、闭管操作、对样品无污染、后期数据分析简单、易懂等优点；本研究拟采用HRM技术研发出针对金黄色葡萄球菌spa基因的新型分子分型方法，该项研究的最终成果将提供一种新的快速、准确、低成本的金黄色葡萄球菌分型方法。HRM技术在临床检验、食品检验、商品检验等领域具有广阔的应用前景。本课题在建立新的金黄色葡萄球菌分子分型方法的同时构建龙岗区金黄色葡萄球菌数据库，以实现金黄色葡萄球菌的长期动态观察和实时监测，可为金黄色葡萄球菌所致食源性疾病的流行病学调查和准确溯源提供主要技术依托；通过与其他实验室数据比较，可为金黄色葡萄球菌的监测、预警、控制作出贡献，有效降低金黄色葡萄球菌的社区获得性感染和院内感染。

蛋白A是从A型金黄色葡萄球菌中分离而得到的细胞壁蛋白，可形成含有A蛋白、抗原及抗体的复合物。蛋白A的spa基因长约为2150 bp，包括X区、Fc结合区及其C末端。其中X区中又包含2～15个重复序列，其长度大约为24 bp，有高度多态性[2,4-5]。由于spa分型的实验结果较容易获取及解释，且能够利用数据库了解不同地区的菌株流行情况，从而为其提供实验依据，并容易进行序列比对和分型。

综上所述，从PFGE结果看，每例患者治疗前后分离的2株菌（A和B）的条带完全相同，虽然利福平对治疗前后分离菌株的最小抑菌浓度差别明显，但每例患者治疗前后分离到的菌株来源相同。此外，spa扩增结果提示患者治疗前后的菌株扩增产物相同，提示spa分型是一个较好的金黄色葡萄球菌快捷基因分型方法。

参考文献

[1] Kumari DN,Keer V,Hawkey PM,et al.Comparision and application of ribosome spacer DNA amplicon polymorphisms and pulsedfield gel electrophoresis for differentiation of methi-cillin- resistant Staphylococcus aureus strains[J].J Clin Microbiol,1997(35):881-885.

[2] Frenary HM,Bunschoten AE,Schouls LM,et al.Molecular typing of methicillin- resistant staphylococcus aureus on the basis of protein A gene polymorphisms[J].Eur J Clin Micro-biol Infect Dis,1996,(15): 60-64.

[3] 闫笑梅,陶晓霞,郑明寰,等.北京分离株金黄色葡萄球菌基因型分析[J]中国病原生物学杂志,2009,5(5):321-324.

[4] Shopsin B,Gomez M,Montgomery SO,et al.Evaluation of protein A gene polymorphic region DNA sequencing for typing of Staphylococcus aureus strains[J].J Clin Microbiol,1999,37(11):3556-3563.

[5] 李剑,陆菊明,潘长玉,等.瘦素受体Gln223 Arg基因多态性与不同葡萄糖耐量血清瘦素的相关性研究[J].军医进修学院学报,2001, 2(4):259-261.

【中图分类号】R378.11

【文献标志码】A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.04.090