榆耳复合防腐剂的抑菌效果及作用方式

刘健美，么宏伟，吴洪军，冯磊*

(1.黑龙江省林业科学院，哈尔滨150081；2.黑龙江省林副特产研究所)



榆耳复合防腐剂的抑菌效果及作用方式

刘健美1，么宏伟2，吴洪军2，冯磊1*

(1.黑龙江省林业科学院，哈尔滨150081；2.黑龙江省林副特产研究所)

摘要：为了明确黑木耳多糖和榆耳水提液的抑菌作用方式和机制，以及其与Nisin复合形成的天然生物防腐剂的抑菌作用效果和作用方式。采用双层抑菌平板法，测出的抑菌圈根据Nisin的效价，分别计算出样品对各种菌的效价。最小抑菌浓度(MIC)的测定，以不长菌的最低榆耳水提液及复配液浓度为对该菌的最小抑菌浓度。采用生长曲线法和琼脂块再培养法来测定榆耳水提液及天然防腐剂复配液的抑菌作用方式。结果表明，复合防腐剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等均有良好的抑菌效果。考察了生长过程中的活菌数，发现前6h活菌数显著降低，从106 cfu/mL降低至102 cfu/mL，在12h以后含有20%的复配液的培养基几乎没有菌的生长，这说明复配液具有较强的杀菌作用。

关键词：榆耳复合防腐剂；抑菌效果；作用方式

研究防腐剂抑菌物质的作用机制，对于评价该物质在食品中的应用前景有重要意义[1]。天然防腐剂抑菌或杀菌的作用机制比较复杂，包括干扰细胞质膜、破坏或损失细胞壁，致使胞内物质外泄，影响有关呼吸链电子传递系统，或影响DNA、RNA合成等，抑制酶活性，干扰正常代谢[2]。目前壳聚糖的抗菌机理目前已提出多种解释，认为壳聚糖与细菌表面残基相互作用，引起细胞渗透压变化，抑制菌体正常生理代谢，导致细胞死亡。或是与DNA作用，抑制RNA和蛋白合成[3]。Nisin通过干扰细胞膜正常功能，造成物质泄漏、养分流失导致细菌死亡[4]。前期实验已经证实了黑木耳多糖和榆耳水提液的抑菌效果，但其作用方式和机制还不清楚。因此与Nisin复合形成的天然生物防腐剂的抑菌作用效果和作用方式的阐明，对于后期复合防腐剂的应用具有重要的理论意义。

1材料与方法

1.1试验材料

金黄色葡萄球菌(Staphylociccusaureus)；大肠杆菌(Escherichiacoli)沙门氏菌(Salmonella)；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)； 蜡样芽孢杆菌 (Bacilluscereus)，均为黑龙江大学生命科学学院食品分析试验室提供。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨液体培养基，双层抑菌培养基(实验室制备)。

1.2试验方法

1.2.1天然防腐剂的制备。榆耳复配天然防腐剂(实验室制备)： 4℃保藏备用。

1.2.2供试菌液的制备。保藏菌种接入牛肉膏蛋白胨液体培养基内(50/250mL的三角瓶)，置于恒温摇床上活化培养，保持转速在 150～160r/min，细菌在 37℃条件下培养 24h，传代2次，进行试验。

1.2.3抑菌试验

1.2.3.1双层抑菌平板法(杯碟法)。本试验采用双层抑菌平板法即杯碟法测定榆耳及榆耳复配液的抑菌活性。具体操作如下：取已灭菌的培养皿水平放置于超净工作台上，倒入适量已灭菌的下层培养基，轻转培养皿使其均匀铺平，待其凝固做为底层；取已灭菌的牛津杯(10 mm×8 mm×6mm)均匀放置其上(每皿不超过 6 支)，另取已灭菌的相应上层培养基5mL，冷却至 50℃左右，将已培养至对数生长期的细菌培养液，菌浓度为106cfu/mL，按照细菌培养液：上层培养基为1∶5(体积比)的比例加入其中，迅速混匀，趁热倒在底层培养基上，均匀摊布，静止放于台面上凝固后，依试验要求在牛津杯中加入待测样品0.1mL，做重复试验。加好样品后，静止1～2min 后盖上培养皿盖，待上层培养基凝固后，将培养皿转移至恒温培养箱内培养(细菌37℃，24h)。上述过程严格要求无菌操作，并尽量保持培养基厚度一致，加菌量和待测样品量相同且在操作中防止气泡产生和样品溢出。待菌苔长好后即可观察抑菌圈，并记录抑菌圈直径以比较各样品的抑菌活性。测出的抑菌圈根据Nisin的效价，分别计算出样品对各种菌的效价。

1.2.3.2最小抑菌浓度(MIC)的测定。取子实体水提液与榆耳复配液加已灭菌的蒸馏水配制成一定梯度的稀释液(水提液含量分别占 10%、15%、20%、25%、50%、80%、100%)。在对应的固体培养平板中分别添加不同浓度稀释液各0.1mL，再分别添加各菌悬液0.2mL，均匀涂布满整个平皿，盖上皿盖，待其稍干后倒置于适宜温度的恒温培养箱内培养(细菌37℃ 18h)，以不长菌的最低榆耳水提液及复配液浓度为对该菌的最小抑菌浓度。本次试验利用平板计数法得出相对应菌的浓度约为106cfu/mL，试验以0.1mL的蒸馏水(即0%水提液)为空白对照，Nisin为阳性对照。

1.2.4防腐剂对细菌的作用方式。本试验采用生长曲线法和琼脂块再培养法来测定榆耳水提液及天然防腐剂复配液的抑菌作用方式。

1.2.4.1生长曲线法。定量称取细菌培养基100 mL装入三角瓶，吸取大肠杆菌5 mL培养过夜，分别将含榆耳水提液10%、20% 和复配液10%、20% 转入上述三角瓶中，震荡摇匀10min，混合均匀后，以无菌操作取5mL混合液分别加入标0、6、12、18、24、36、48h的7支试管中，并作空白对照，将试管置于摇床(250r/min)37℃ 震荡培养，按相应时间放入冰箱中贮存，最后用平板活菌落计数法测定残存的活菌数，以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制大肠杆菌指示菌的生长曲线。

1.2.4.2琼脂块再培养法。将约为106cfu/mL的大肠杆菌菌悬液0.1mL涂布于含榆耳复合防腐剂的营养琼脂平板上，置37℃下培养24h，以无菌操作切取经培养后未长菌的琼脂块，加到装有LB培养液的三角瓶中，剧烈振荡lh后，置37℃培养24h，平板菌落计数法检测培养前后培养液中的活菌数。

2结果与分析

2.1榆耳复合天然防腐剂的抑菌活性

供试菌均为食品中常见引起食物腐败的腐败菌，因为以此为对象，具有一定的代表性。分别在各供试菌平板上牛津杯中加入复合防腐剂，100 μL/孔，以Nisin为阳性对照、无菌水为阴性对照。在适宜温度下培养24h，测定抑菌圈直径，结果如表1。

表1　榆耳防腐剂复配液对不同菌的效价

由表1可以看出，在添加很少量天然防腐剂的复配液抑菌效果很强，尤其是对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的抑菌效果高达95 IU/mL，对大肠杆菌等革兰氏阴性菌的抑菌效果也提升至67 IU/mL以上。表明不同抑菌特性的抗菌物质复配的复合防腐剂具有协同作用，有效扩宽了抑菌谱，对多数革兰氏阳性菌和阴性菌均有广泛的抑菌效果。但对阳性菌的抑制效果强于阴性菌，这可能与革兰氏阳性和阴性菌细胞壁结构有关。Nikaido等[5]研究表明，与革兰氏阳性菌相比，革兰氏阴性菌有独特的外膜结构，对于抑菌物质具有一定的抵抗作用，而且不同种类的抑菌物质对不同细菌具有不同的抑菌作用。详细机制还有待进一步研究。

2.2复合防腐剂的MIC

表2　榆耳复合天然防腐剂的MIC

注：—表示未见菌落生长；+ 表示有少量菌落生长；++ 为菌落较多但少于平皿面积 1/3；+++菌落达到平皿面积 1/2 及以上。

由表2观察可知，复合防腐剂浓度在15%时，对大肠杆菌、沙门杆菌、和蜡样芽孢杆菌菌落有少量的生长，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌并未长菌；然而当复合防腐剂浓度在20%时，所有菌本未见生长，表明复配液具有良好的抑菌活性，并得出复合防腐剂的MIC为20%。由此可见，复合防腐剂的浓度为20%时，能够抑制所有细菌生长。

2.3榆耳复合天然防腐剂抑菌作用方式

防腐剂对微生物的作用方式有抑菌、杀菌或兼而有之。通过测定微生物生长状况，可以评价不同抗菌物质对微生物作用的效果。通过不同培养时间取样测定培养液中指示菌的吸光度和活菌数，可初步确定抗菌物质对指示菌的作用方式。

2.3.1榆耳复合防腐剂对指示菌生长曲线的影响。将含10%、20% 浓度的榆耳复合防腐剂与大肠杆菌在37 ℃下培养，在48h内定时取样，测吸光度绘制生长曲线。如图1可知，培养初期0～18h，在复合防腐剂的作用下，与正常相比，指示菌的菌数显著降低，防腐剂抑菌情况下，菌体的吸光度值均在0.2以下，而且复合防腐剂浓度越高，菌数越少，说明防腐剂具有很强的抑菌能力。培养后期18～48h，含复配液的样品OD值维持在0.2以下，可以看出添加天然防腐剂的复配液抑菌作用很稳定，而且18h之后，菌体OD值有逐渐下降的趋势，表明菌落总数也在明显减少，这说明复合防腐剂不仅有抑菌作用，而且还有一定的溶菌作用。

图1　不同浓度榆耳水提液和防腐剂复配液对

图2　不同浓度榆耳水提液和防腐剂复配液抑菌后的活菌数

分别将含10%、20% 浓度的榆耳复合防腐剂与大肠杆菌在37℃下培养，在48h内定时取样，利用平板计数法测定活菌数，结果如图2所示。

由图2可知，在10%和20%复合防腐剂的作用下，6h内活菌数急剧下降，由106cfu/mL下降到102cfu/mL，而随着时间的延长，大肠杆菌的活菌数还在明显下降，在12h以后含有20%的复配液的培养基几乎没有菌的生长，这说明复配液具有较强的杀菌作用。

2.3.2榆耳复合防腐剂的作用方式。通过测定活菌数，结果含有复合防腐剂的平板上含有74 cfu/mL，将未长菌的琼脂块加入液体LB培养基，震荡1h之后转接到平板，培养24h后，活菌数增加到2.8×104cfu/mL。说明经过一定时间培养后，未长菌的琼脂块仍有活菌残留，这部分菌应该是受到抑制。所以榆耳复合天然防腐剂对细菌的作用方式为抑菌和杀菌共有。

3结论

采用杯碟法、生长曲线法及琼脂块再培养法，研究了复合防腐剂的抑菌效果及对细菌的作用方式。结果表明，复合防腐剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等均有良好的抑菌效果。随着防腐剂的浓度增加，对各供试菌的抗菌活性也显著增强，但不同供试菌对复合防腐剂的抗菌作用敏感性不一致。以大肠杆菌为指示菌，显示复合防腐剂的MIC为20%。生长曲线实验结果表明，复合防腐剂显著抑制指示菌的生长繁殖，具有较强的抑菌作用，在后期供试菌OD降低，表明防腐剂除了抑菌作用，还有一定的溶菌作用。进一步考察了生长过程中的活菌数，发现前6h活菌数显著降低，从106降低至102cfu/mL，在12h以后含有20%的复配液的培养基几乎没有菌的生长，这说明复配液具有较强的杀菌作用。采用琼脂块再培养法进一步研究防腐剂的作用方式，发现经过一定时间培养后，未长菌的琼脂块仍有活菌残留，这部分菌应该是受到抑制。所以榆耳复合天然防腐剂对细菌的作用方式为抑菌和杀菌共有。

参考文献

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[5]Nikaido H.Multidrug efflux pumps of gram-negative bacteria[J].Journal of bacteriology,1996,178(20):5853.

中图分类号:TS202.3

文献标识码:A

*通讯作者：冯磊(1981—)，男，副研究员，从事非木质林产品加工、保藏方面研究，E-mail: lkykjc@126.com。

基金项目：黑龙江省森林工业总局重点科研攻关项目(sgzjY2012008)；黑龙江省省属科研院所基本科研业务费专项

收稿日期：2015-11-03

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.02.008