miR－21靶向调控STAT3基因抑制人乳腺癌MCF－7细胞的侵袭

赵守香　王涛　李玉军

作者单位：266003青岛市，青岛大学附属医院病理科（赵守香　李玉军）121013　锦州市，辽宁医学院医疗学院（王涛）



miR－21靶向调控STAT3基因抑制人乳腺癌MCF－7细胞的侵袭

赵守香王涛李玉军

作者单位：266003青岛市，青岛大学附属医院病理科（赵守香李玉军）121013锦州市，辽宁医学院医疗学院（王涛）

【摘要】目的探讨miR－21和信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）基因在人乳腺癌MCF－7细胞中的表达，阐明miR－21对STAT3基因的靶向作用及其对MCF－7细胞侵袭的影响。方法购买并培养MCF－7细胞，采用免疫荧光法检测STAT3在癌细胞中的表达。运用生物信息学方法对miR－21和STAT3基因的靶向配对关系进行预测，采用荧光素酶报告系统鉴定；脂质体2000转染miR－21模拟物后，qRT－PCR检测miR－21和STAT3 mRNA在癌细胞中的表达，Western blot检测STAT3蛋白在癌细胞中的表达，Transwell小室检测MCF－7细胞体外的侵袭性。结果光镜下可见人乳腺癌MCF－7细胞成片生长，有突起；细胞免疫荧光法检测结果显示胞质内有STAT3蛋白的表达，显示红色荧光。生物信息学软件miRanda和TargetScan显示miR－21和STAT3基因二者靶向配对良好，荧光素酶报告系统鉴定发现miR－21 mimics能够抑制STAT3 mRNA表达。qRTPCR和Western blot检测结果表明过表达miR－21能够降低STAT3 mRNA和蛋白的表达。Transwell小室实验结果表明miR－21的过表达能够抑制MCF－7细胞的侵袭。结论miR－21通过负性调控人乳腺癌MCF－7细胞中STAT3基因的表达，进而抑制癌细胞的侵袭。

【关键词】微小RNA；信号传导与转录激活因子3；乳腺癌MCF－7细胞；生物信息学

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势并呈现年轻化特点，手术切除不仅对患者身体造成极大地创伤，也对女性患者造成极大地心理负担。因此，探寻乳腺癌的发生发展机制及其新的治疗方法在当前是迫切的。信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）是一种与酪氨酸磷酸化信号通道偶联的功能蛋白，主要存在于线粒体中［1，2］。最近研究［3，4］发现STAT3在乳腺癌组织中异常高表达，对肿瘤的发生发展起着重要作用。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类非编码RNA，长度大约为21～25 nt，通过与靶基因mRNA 3＇端非翻译区（3＇untranslated regions，3＇UTR）互补，降解目的基因并下调其表达［5］，以此参与疾病发生过程中基因表达的调控。

本文研究应用生物信息学方法对miR－21和STAT3基因的靶向配对关系进行预测，并采用荧光素酶报告系统鉴定STAT3基因在乳腺癌细胞中的表达；脂质体2000转染miR－21模拟物进入人乳腺癌MCF－7细胞后，qRT－PCR检测miR－21和STAT3 mRNA在癌细胞中的表达，Western blot检测STAT3蛋白在癌细胞中的表达，阐明miR－21对STAT3基因的靶向作用；Transwell小室检测癌细胞体外的侵袭性，揭示miR－21对人乳腺癌MCF－7细胞生物学行为的影响，现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1主要仪器与试剂DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自Gibico公司，反转录试剂盒、pMD 18－T载体、DNA连接试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、RNAiso for small RNA和SYBR Premix Ex Taq II购自TaKaRa公司，pmirGLO质粒和Dual－Luciferase报告系统购自Promega公司，质粒提取试剂盒购自Axygen公司，脂质体2000购自Invitrogen公司，miR－21 mimics购自GenePharma公司，兔抗人STAT3抗体购自Santa Cruz公司，人乳腺癌MCF－7细胞购自上海生物细胞研究所。

1.2MCF－7细胞培养及免疫荧光检测STAT3表达MCF－7细胞接种于25 cm2培养瓶内，孵箱中（37℃、5%CO2）培养，每3 d换一次液，细胞贴壁达到80%左右，用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化并传代。取适量细胞涂片，10%甲醛固定后，0.1%BSA封闭1 h，加兔抗人STAT3抗体，室温孵育1 h，PBS冲洗3次，每次5 min，二抗加TRITC标记山羊抗兔IgG抗体（1∶200），DAPI复染细胞核。

1.3生物信息学方法预测运用miRNA生物信息学软件miRanda（http://www.microrna.org/）和TargetScan（http://www.targetscan.org/）对miR－21和STAT3基因的靶向配对关系进行预测。

1.4荧光素酶报告系统鉴定提取MCF－7细胞的总RNA并反转录为cDNA，运用正向引物5＇－CCGAGCTCATTTGTCCACCAGCATTA－3＇和反向引物5＇－GCTCTAGAAGCCAGCCAGTATTTTA－3＇扩增STAT3 mRNA的3＇UTR。Sac I和Xba I双酶切STAT3 3＇UTR以及pmirGLO质粒，DNA连接试剂盒连接酶切片段，构建荧光素酶报告载体（3＇UTR－pmirGLO），转化入感受态细胞中扩增，质粒提取试剂盒提取重组质粒。脂质体2000转染STAT3 3＇UTR－pmirGLO以及miR－21 mimics或对照miRNA，Dual－Luciferase报告系统检测荧光强度。

1.5qRT－PCR检测取转染miR－21 mimics的MCF－7细胞以及空白对照组细胞，分别加入Trizol 或RNAiso for small RNA（TaKaRa）提取总mRNA或总miRNA，运用反转录试剂盒反转录为cDNA，稀释后加入SYBR Premix Ex Taq II（TaKaRa）和引物（表1），跑40个循环的PCR反应，并对反应结果进行定量分析。

表1　引物序列

1.6Western blot检测取转染miR－21 mimics的MCF－7细胞及对照组细胞，分别加入RIPA裂解液充分震荡，超声破碎，在4℃下以离心半径8 cm，12000 r／min离心20 min，采用BCA法测定样品总蛋白量。取15 μl样品经SDS－PAGE分离后转膜，用4%BSA封闭1 h，加入兔抗人STAT3抗体（1∶200），4℃过夜后，滴加二抗（1∶800），4℃摇床1 h后凝胶成像系统ECL发光显影，以β－actin作为内参。

1.7Transwell小室检测MCF－7细胞体外侵袭将转染miR－21 mimics的MCF－7细胞以及空白对照组细胞加入无血清培养基并置入Transwell上室中，下室加入含10%FBS的RPMI1640培养基，24 h后，取出小室，用甲醇固定小室反面细胞20 min，于结晶紫染液中染色15 min。光镜下取3个随机视野计算穿膜细胞数。

1.8统计学处理采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组间计量资料的比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1MCF－7细胞培养及免疫荧光法检测STAT3表达光镜下可见人乳腺癌MCF－7细胞成片生长，有突起，见图1A；细胞免疫荧光法检测结果显示胞质内有STAT3蛋白的表达，呈红色荧光，见图1B～D。

图1　MCF－7细胞形态学观察

2.2miR－21和STAT3基因靶向配对关系分别运用TargetScan和miRanda生物信息学软件对miR－21和STAT3（NM＿003150）基因的靶向配对关系进行预测，TargetScan显示miR－21在STAT3 mRNA 3＇UTR上有一个保守的靶位点，其类型为7mer－m8，匹配得分为95。miRanda结果表明miR－21与靶位点的mirSVR得分为－0.7660，综合两个生物信息学软件预测结果可以看出miR－21与STAT3基因配对良好，见表2。

2.3荧光素酶报告系统鉴定结果荧光素酶报告系统检测结果显示，将对照组STAT3 3＇UTR－pmirGLO荧光素酶的表达量设为100%，则miR－21 mimics能使STAT3 3＇UTR－pmirGLO的荧光素酶表达量下降为（46.98±6.01）%，二者经比较差异有统计学意义（t＝2.732，P＜0.05），见图2。

2.4qRT－PCR检测miR－21和STAT3 mRNA的表达结果将对照组miR－21的表达量设为100%，则转染组的相对表达量是（21.08±7.48）%，两者差异有统计学意义（t＝3.286，P＜0.05），见图3a。将对照组STAT3 mRNA的表达量设为100%，转染后发现STAT3 mRNA的表达量下降至（49.97±8.62）%，两者差异有统计学意义（t＝2.461，P＜0.05），见图3b。

图2　荧光素酶相对活性

图3　转染后miR－21和STAT3 mRNA的相对表达

2.5Western blot检测STAT3蛋白的表达水平Western blot检测结果显示，miR－21 mimics组STAT3蛋白相对表达量（0.46±0.11）较对照组（0.83± 0.17）明显降低，且差异具有统计学意义（t＝2.269，P＜0.05），见图4。表明过表达miR－21能够降低STAT3蛋白的表达，结合荧光素酶报告系统以及qRT－PCR检测结果，表明miR－21能够靶向作用STAT3 3＇UTR负性调控STAT3基因表达。

2.6Transwell小室检测miR－21抑制MCF－7细胞的侵袭结果Transwell小室检测MCF－7细胞的体外侵袭能力，发现转染组（mimics）的穿膜细胞数（19.27±6.54）较空白对照组（85.46±10.35）明显降低，差异有统计学意义（t＝4.095，P＜0.05），见图5。

3　讨论

表2　miR－21与STAT3基因靶向配对关系

研究发现在非哺乳期STAT3能够促进乳腺的退化［6］，但在癌症中STAT3的激活具有致瘤性［7］。STAT3基因定位于人类第12号染色体上，生理状态下STAT3蛋白的激活是快速而短暂的，有利于维持细胞正常的生理功能，而持续性的激活可参与诱导细胞增殖、分化以及凋亡，其下游基因伴随异常高表达，致使癌症产生，该途径在乳腺癌中尤为突出［8－10］。大约70%的乳腺癌中都有STAT3的激活，并且发生在各级乳腺癌尤其是缺乏雌激素受体或孕激素受体表达的三阴性乳腺癌［11］。在乳腺癌中，STAT3主要由白介素－6（interleukin，IL－6）所激活，许多乳腺癌细胞系能够产生IL－6，其通过IL－6受体和JAK激酶信号通路以自分泌的方式激活STAT3，进而上调增殖、侵袭和凋亡抑制基因的表达，促进癌细胞的上皮间质转化，改变细胞的形态以及运动潜能，对癌细胞的生物学行为有重要影响［12－14］。此外，除了通过酪氨酸磷酸化激活STAT3之外，STAT3也能够通过羧基末端的丝氨酸残基被磷酸化而激活，大约60%乳腺癌STAT3的激活都是丝氨酸磷酸化，并与雌激素受体阴性的肿瘤相关联。最近有研究［15］发现丝氨酸磷酸化的STAT3可在癌细胞的线粒体中找到，通过对线粒体功能的影响促进癌细胞的存活。

图4　转染后STAT3蛋白的表达

图5　Transwell检测MCF－7细胞的侵袭力

本文研究发现，光镜下可见人乳腺癌MCF－7细胞成片生长，有突起；细胞免疫荧光检查结果显示，胞质内有STAT3蛋白的表达，显示红色荧光；qRTPCR和Western blot检测结果均表明，乳腺癌MCF－7细胞内有STAT3 mRNA和蛋白的高表达，提示STAT3基因与乳腺癌关系密切，或可作为其临床诊断指标之一。

miRNA已被证实与乳腺癌密切相关，在癌症的发生发展中起重要作用［16］。Wang等［17］研究发现，在乳腺癌细胞中miR－204能够靶向调控JAK2基因的表达，并能够通过STAT3／BCl－2／survivin信号转导通路诱导癌细胞凋亡。本文研究运用生物信息学方法对miR－21和STAT3基因的靶向配对关系进行预测，发现二者配对关系良好，采用荧光素酶报告系统鉴定发现miR－21能够抑制STAT3 mRNA表达；脂质体2000转染miR－21 mimics后，qRT－PCR和Western blot检测结果均表明，过表达miR－21能够降低STAT3 mRNA和蛋白的表达。Transwell小室检测结果发现过表达miR－21能够抑制MCF－7细胞的侵袭能力，提示miR－21通过靶向作用于STAT3基因能够抑制乳腺癌MCF－7细胞的侵袭。由此可以得出，miR－21通过负性调控人乳腺癌MCF－7细胞中STAT3基因的表达，进而抑制癌细胞的侵袭。上述研究结果与Dong等［18］的研究中miR－21能够促进癌细胞转移的结论相反，可能与实验对象、条件、环境、操作者等因素都会对结果产生一定影响有关，具体原因有待进一步研究。

综上所述，miR－21能够通过负性调控人乳腺癌MCF－7细胞中STAT3基因的表达，进而抑制癌细胞的侵袭。本文研究为深入探讨乳腺癌的发生、发展机制及其新的治疗途径奠定了一定的基础。

4　参考文献

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18Dong G，Liang X，Wang D，et al.High expression of miR－21 in triple－negative breast cancers was correlated with a poor prognosis and promoted tumor cell in vitro proliferation.Med Oncol，2014，31：57.

（本文编辑：陈淑莲）

消息

The role of miR－21 in human breast cancer MCF－7 cells invasion by regulating STAT3 expression

ZHAO Shou－xiang1，WANG Tao2，LI Yu－jun1.1Department of Pathology，the Affiliated Hospital，Qingdao University，Qingdao 266003，China2Medical Treatment College，Liaoning Medical University，Jinzhou 121013，China

【Abstract】Objective To identify expressions of miR－21 and signal transducer and activator of transcription 3（STAT3）in human breast cancer MCF－7 cells and explore the role of miR－21 on cell invasion which regulate expression of STAT3.Methods MCF－7 cells were cultured in vitro.Cell morphology was observed by phase contrast microscope and the expression of STAT3 in MCF－7 cells was determined by immunofluorescence cytochemistry method.MiR－21 which regulated expression of STAT3 was predicted by bioinformatics and identified with luciferase assay.After transfection of miR－21 mimics into cells，the expressions of miR－21 and STAT3 were determined by qRT－PCR and Western blot.The invasion of MCF－7 cells was detected in vitro by transwell chamber.Results The MCF－7 cell grew flakily with prominency under light microscope.Expression of STAT3 was positive by immunofluorescence cytochemistry.MiRanda and TargetScan showed that miR－21 was well complementary with STAT3 gene.MiR－21 mimics could inhibit STAT3 mRNA expression showed by luciferase assay.Results of qRT－PCR and Western blot showed that over－expression of miR－21 down－regulated expression of STAT3 mRNA and protein.The invasion of MCF－7 cells was suppressed after transfection of miR－21 mimics.Conclusion MiR－21 may negatively regulate STAT3 expression in human breast cancer MCF－7 cells and inhibit cells invasion.

【Key words】miRNA；Signal transducer and activator of transcription 3；Breast cancer MCF－7 cells；Bioinformatics

收稿日期：（2016－01－23）

doi：10.3969／j.issn.1674－7151.2016.01.002

通讯作者：李玉军，E－mail：liyujun.66@163.com