CAR-T细胞的作用机制及其在B淋巴细胞血液恶性肿瘤治疗中的研究进展

张天生，郑小丽，祝 芳， 姬新

1. 河南大学 第一附属医院，河南 开封 475001； 2. 河南大学 医学院 抗体药物河南省国际联合实验室，河南 开封 475004



CAR-T细胞的作用机制及其在B淋巴细胞血液恶性肿瘤治疗中的研究进展

1. 河南大学 第一附属医院，河南 开封 475001； 2. 河南大学 医学院 抗体药物河南省国际联合实验室，河南 开封 475004

摘要：〔结论〕 应用嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)治疗急性和慢性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤,在近期已取得了快速进展。CAR-T细胞是将T细胞受体基因和抗CD19抗体基因嵌合，转染至T细胞，在体外扩增后回输给患者来治疗B淋巴细胞血液恶性肿瘤的新型靶向治疗方法。经过基因改造后的CAR-T细胞的表面具有特异性位点，可以识别B淋巴细胞血液恶性肿瘤中B细胞表面的CD19抗原。CD19抗原的持续刺激可使CAR-T细胞不断增殖活化，有效杀伤肿瘤细胞。本文就嵌合抗原受体(CAR)的结构、CAR-T细胞抗肿瘤作用的机制,及其对B淋巴细胞血液恶性肿瘤的临床应用进行综述。

关键词：CAR-T；急性淋巴细胞白血病； B细胞淋巴瘤；细胞免疫；生物治疗

B淋巴细胞血液恶性肿瘤主要包括急性淋巴细胞白血病 (acute lymphoblastic leukemia，ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)及B细胞淋巴瘤。长期以来，血液系统恶性肿瘤以放疗、化疗及手术等作为传统的抗肿瘤治疗模式，复发和难治常常是导致治疗失败的主要原因。利妥昔单抗(美罗华)的问世使表达CD20的成熟B细胞淋巴瘤、白血病的生存率有了大幅度的提升，然而仍然有20%-30%患者因复发和难治而死亡[1-2]。近几年来，随着特异性识别B细胞表面CD19的嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T)的研究及其在B淋巴细胞血液恶性肿瘤治疗中的应用，该类疾病的生存率和治愈率有望进一步提高。

1CAR的结构

CAR是由T细胞受体的胞外抗原结合区、跨膜区及胞内信号区三部分组成。胞外区具有抗体单链可变区片段，能特异性识别特定肿瘤抗原，将其转染至T细胞所制备的CAR-T，便具有了抗体的特异性和效应T细胞的细胞毒作用。且利用该胞外区单链的可变性,可以制备出与不同的肿瘤抗原结合的CAR-T，因此胞外区决定了CAR的特异性。而近几年来通过对胞内信号区设计的改造，CAR-T经历了从1代到4代的变迁。

2CAR-T细胞抗肿瘤作用的原理

细胞毒T细胞(cytotoxic T cell，CTL)是经抗原递呈细胞激活的CD8+ T淋巴细胞，该活化过程需要双信号途径。第一信号途径为抗原递呈细胞上的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子-抗原肽复合体与T细胞上的T细胞受体(T cell receptor，TCR)结合，第二信号为抗原递呈细胞上的共刺激分子B7与T细胞上的CD28分子结合，在这两种信号的共同作用下，T细胞会活化增殖为CTL细胞。当CTL细胞再次遇到携带有相同MHC分子-抗原肽复合体的肿瘤细胞时，就会通过同样的机制与之结合，并分泌穿孔蛋白、粒酶及细胞因子,协同作用杀死肿瘤细胞。早期设计的第一代CARs比较简单，仅有一个胞内信号区，信号主要通过CD3ζ上的免疫受体酪氨酸激酶活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM) 传导，缺乏T细胞增殖的第2信号，T细胞在结合肿瘤抗原后很难进一步增殖，因此只有较弱的抗瘤作用[3]。

第二代CARs是在第一代的基础上进行了改造，将传递第2信号的CD28或4-1BB分子的活性域这些共刺激分子与CD3ζ串联起来整合到CAR中，从而提高了T细胞的效应功能[4]。当在体内遇到肿瘤抗原后， 第 2 代CAR-T细胞在杀死肿瘤细胞的同时，还能完成自身的扩增。在CAR-T细胞中加入共刺激信号4-1BB可增强CAR-T细胞在体内的存活时间、 肿瘤定位的CAR-T细胞增多以及抗肿瘤能力提高[5]。因其表现出了良好的抗肿瘤作用，目前二代CAR-T用于临床研究中输注。

第三代CARs的胞内信号区含有两个共刺激分子(如CD28与CD137/CD134嵌合体与CD3-ζ串联组成)，在这种外源性共刺激分子的作用下，这些转基因CAR-T细胞可产生足够的白介素2(IL-2)促进其增殖。与2代CAR相比，3代CAR具有较强的细胞溶解作用， 且其体内扩增能力及产生细胞因子能力更强。从CAR-T细胞胞内信号区和活化区结构及功能来推论其体内抗肿瘤活性的话， 2代CAR优于1代CAR， 3代CAR优于2代CAR， 但最近研究表明CAR-T细胞的功能活性除与其胞内的信号序列有关外， 还与靶细胞提供的内源性受体有关[6]。 3代CARs是否优于第2代,CARs还有待于临床验证。

第四代CAR-T是基于1-3代CAR-T在输注前需对患者进行预处理而设计的。Pegram[7]设计了具有分泌IL-12且靶向CD19的CAR-T细胞，可以在患者缺乏预处理的情况下具有抗CD19+肿瘤作用，使患者免受预处理治疗的毒副反应，拓宽了CAR-T细胞的临床应用范围。

3CAR-T对B淋巴细胞血液恶性肿瘤的临床应用

3.1抗CD19 CAR-T细胞相关临床研究

CAR-T在B淋巴细胞血液恶性肿瘤的研究中已取得了令人瞩目的成就，因为B淋巴细胞肿瘤细胞表面常稳定表达CD19分子，所以针对CD19的CAR-T靶向治疗显示出良好的应用前景。

2014年第56届美国血液学会(American Society of Hematology，ASH)年会上，共收录55篇有关CAR-T细胞的研究摘要，其中在口头报告的14篇中就有11篇是抗CD19 CAR-T的相关研究。在本届年会上，来自美国国家癌症中心的Rosenbeng课题组口头报告了30例难治性B细胞淋巴瘤患者在接受靶向CD19的第二代CAR-T细胞治疗后，27例可评估病例中有22例获得完全缓解(CR)或部分缓解(PR),最长的CR持续了37个月。该中心在本次ASH会议上报告了他们的最新进展：通过减低化疗剂量联合CAR-T治疗9例化疗耐药的弥漫大B细胞淋巴瘤，获得1例CR、4例PR、2例预后差的临床结果[8]，且9例患者均未产生明显的不良反应。提示低剂量化疗联合CAR-T对进展性B细胞淋巴瘤有可能成为标准治疗方案。该课题组还报告了第二代抗CD19 CAR-T细胞治疗20例复发难治ALL后能取得67%的CR率，且61%的患者脑脊液中可以检测到CAR-T细胞，提示了CAR-T细胞清除中枢系统白血病细胞的治疗潜力。来自宾夕法尼亚大学的June课题组在本届ASH会议上报告了第二代抗CD19的CAR-T细胞治疗39例复发难治的儿童ALL的临床研究结果，其中36例(92%)患儿达到CR，包括1例异常表达CD19的T-ALL；3例患者无应答，10例在随访期间复发。他们发现CAR-T细胞可在体内富集扩增，体内存活时间可以维持2年以上[9]。在会议报告中，June还指出抗CD19的CAR-T细胞能够识别低表达的抗原，在CD19弱表达的多发性骨髓瘤的小样本研究中也显示出较好的疗效。

3.2抗CD19 CAR-T细胞临床应用中的不良反应与潜在风险

CAR-T细胞应用过程与其他大多数细胞过继输入治疗相类似，需要配合使用细胞因子及其他相关处理，常见的不良反应有寒战、发热、白细胞减少、肿瘤溶解综合征、细胞因子风暴、B细胞缺乏引起的低免疫球蛋白血症等[10]。Brentjens[11]等也有关于输注CAR-T细胞后发生严重感染致死的报道。另外，在CAR-T细胞的制备过程中，需要将抗体序列及T细胞受体信号途径的编码分子相关的序列导入T细胞内，尽管目前常用的逆转录病毒、慢病毒、转座子、mRNA电转入等方式导入外源基因进行治疗被认为是安全的，但是由于外源基因是随机整合至宿主基因组并在细胞内长期存在且稳定表达，存在不合适的插入位点突变就有可能会引起细胞发生转化的潜在风险[12]。

针对血液B淋巴细胞恶性肿瘤的CAR-T细胞，目前已在全球范围内引起极大关注，不少国家和地区的医疗、科研机构已进行了大量的临床试验。在临床使用过程中，因为其应用时间较短，更多的不良反应和并发症尚不十分清楚。但是由于其在治疗B细胞恶性肿瘤尤其是对复发、难治性B细胞恶性肿瘤中，还可作为补救治疗并显示出显著的治疗效果，因此CAR-T细胞免疫治疗在临床中的应用和推广非常值得期待。

参考文献：

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[11] Brentjens R, Yeh R, Bernal Y, et al. Treatment of chronic lymphocytic leukemia with genetically targeted autologous T cells: case report of an unforeseen adverse event in a phase I clinical trial[J]. Mol Ther, 2010,18(4):666-668.

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[责任编辑李麦产]

Antitumor mechanism of CAR-T cells and their advances in the treatment of hematologic malignancies in B lymphocytes

1. The First Affiliated Hospital of Henan University, Henan Kaifeng 475001, China; 2. Medical College of Henan University, Henan International Union Laboratory of antibody drugs, Henan Kaifeng 475004, China

Abstract:Application of chimeric antigen receptor T CAR-T chimeric receptor T (antigen cell) in the treatment of acute and chronic lymphocytic leukemia, B cell lymphoma in the near future has made rapid progress. CAR-T cell is the T cell receptor gene and anti CD19 antibody gene chimeric, transfected to T cells, in vitro amplification of the patient after the return to the treatment of B lymphocytes in the blood of malignant tumors of the new targeted therapy. After the transformation of the CAR-T cell surface with specific sites, you can identify the B lymphocytes in the blood of malignant tumor B cell surface CD19 antigen. The continuous stimulation of CD19 antigen can activate CAR-T cells to proliferate and activate, and kill the tumor cells effectively. in this paper, we reviewed the structure of chimeric antigen receptor (CAR), the mechanism of anti tumor action of CAR-T cells and the clinical application of B lymphocytes in the treatment of hematological malignancies.

Key words:CAR-T; acute lymphoblastic leukemia; B cell lymphoma; cellular immunity; biological therapy

中图分类号：R967

文献标志码：A

作者简介：张天生(1980-)，男，河南人，河南大学第一附属医院主治医师，从事血液病临床工作。 通信作者：姬新颖(1963-)，男，河南新安人，河南大学医学院教授，从事细胞免疫研究与治疗工作。

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81270142，81470545)

收稿日期：2015-10-16

文章编号：1672-7606(2016)01-0071-03