狼毒水煎液对A549细胞增殖及迁移的影响

孟明静，耿胜男，郑亚秋， 杜钢

河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004



狼毒水煎液对A549细胞增殖及迁移的影响

河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004

摘要：〔目的〕 观察狼毒水煎液对人肺癌A549细胞增殖和迁移的影响。〔方法〕 MTT实验测定该药对人肺癌A549细胞增殖的影响，划痕实验法测定该药对人肺癌A549细胞迁移的影响。〔结果〕 与对照组相比，狼毒水煎液对实验组肺癌A549细胞的增殖以及迁移均有一定的抑制作用，抑制作用与药物浓度呈正相关。〔结论〕 狼毒水煎液对人类非小细胞型肺癌有一定的抑制作用。

关键词：狼毒；水煎液；人A549细胞；增殖；迁移

据统计，当今世界肺癌的发病率约占各种癌症的五分之一，居各种肿瘤发病率首位，对人类的健康以及生存质量构成了严重威胁。我国是肺癌高发区，每年都有十几万人死于肺癌，已成为恶性肿瘤死亡的首要原因，并且发病率和死亡率在逐年上升，有大部分患者在确诊时已是中晚期，失去了最佳治疗时机，这样给治疗带来了很大的难度，给患者、医生以及社会带来了严重的负担。而非小细胞型肺癌约占肺癌总数的80%～85%，包括鳞癌、腺癌和大细胞癌，其癌细胞分裂较小细胞癌慢，扩散转移较小细胞癌晚。放化疗和手术在非小细胞型肺癌的治疗方面起到了重要的作用，但对于年龄大、体力状态差及不能接受手术的患者，由于化疗抑制骨髓造血系统、产生免疫抑制等一系列副作用及放疗并发症的发生，在延长患者寿命和提高生存质量方面的作用并不理想，使得他们在非小细胞肺癌的治疗方面受到了一定的限制。近年来，中药在缓解非小细胞肺癌症状，提高生存质量方面的作用尤为突出，成为治疗非小细胞型肺癌的重要方法之一，在其治疗方面得到了广泛认可[1]。

狼毒，别名续毒、川狼毒，瑞香科瑞香狼毒或大戟科植物狼毒大戟的根，产于东北、华北、西北、西南及西藏等地，有泻水逐饮、破积杀虫之功效，可用于治疗水肿腹胀、痰食虫积、心腹疼痛、症瘕积聚、结核、疥癣等。狼毒也有一定的抗肿瘤作用，能够抑制肝癌、肺癌、胃癌等多种肿瘤细胞的增殖和迁移。王敏等[2]通过研究证实了狼毒的抗肿瘤活性，其临床用途也在不断扩大。杨柯等[3]通过研究证实了狼毒水提液对人肺癌A549细胞凋亡的诱导作用。我们通过体外实验研究狼毒水煎液对人肺癌A549细胞增殖及迁移的影响来探究狼毒水煎液抑制非小细胞型肺癌的作用，以期为狼毒水煎液抑制非小细胞型肺癌的临床应用提供指导。

1材料

1.1药品

狼毒饮片。取狼毒饮片20 g，置于冷水中浸泡0.5 h，然后小火煎煮，煎至水刚没过药渣，倒出药水，药渣留在砂锅中，加水继续煎煮。重复以上做法2次。将3次倒出的药水混合在一起，浓缩至200 mL，即使其浓度为0.1 g/mL,放冷，置于4 ℃保存，备用。

1.2试剂

DMEM基础培养液，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(宝信生物科技有限公司)，MTT(Sigma公司)，PBS缓冲溶液(由磷酸二氢钾、氯化钾、磷酸二氢钠、氯化钠、吐温-20加水配制而成)，DMSO。

1.3瘤株

人A549肺癌细胞，由中科院提供，河南大学药理实验室传代培养。

1.4仪器

HDL洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)， ZXC紫外消毒车(上海跃进医用光学器械厂)，LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)，CO2培养箱(德国Heraeus公司)，电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，ElX-800酶联检测仪(美国 BIO-IEK公司)，电子天平(上海丽驰计量仪器有限公司)，YN-ZD-2电热蒸馏水器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)，CHA-S恒温振荡器(常州国华电器有限公司)，TDL-508台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，BD-400冰柜(河南冷柜厂)，XDS-500D倒置显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)，相机(奥林巴斯有限公司)，96孔板，6孔板，移液枪，EP管，细胞计数板，Marker笔，直尺，20 μL枪头，弯头吸管。

2方法

2.1对人肺癌A549细胞增殖的影响

2.1.1消化细胞并计数将铺满培养瓶的人肺癌A549细胞用胰蛋白酶液消化、离心，加DMEM完全培养基(血清∶DMEM=1∶9)，吹打成单细胞悬液，用细胞计数板计数。

2.1.2稀释细胞浓度将细胞接种于96孔细胞培养板根据需要加入完全培养基调整细胞浓度，使得每孔加入约104个细胞，吹打均匀，100 μL/孔点入96孔板，设置调零孔。调零孔只加入100 μL DMEM完全培养基，置于体积分数为5%的CO2培养箱中，在37 ℃条件下培养16 h。

2.1.3加药取出细胞培养板，以100 μL/孔加入狼毒水煎液。给药组设置5个浓度梯度，浓度分别为50倍稀释药物(2 g/L)、100倍稀释药物(1 g/L)、200倍稀释药物(0.5 g/L)、400倍稀释药物(0.25 g/L)、800倍稀释药物(0.125 g/L)。每组设置4个复孔，另设置对照孔，对照孔和调零孔均不加药，只加入100 μL DMEM完全培养基，然后置于体积分数为5%的CO2培养箱内，在37 ℃条件下培养48 h。

2.1.4加MTT取出细胞培养板，小心弃去各孔内的培养液，每孔加入 0.5 g/L的MTT溶液100 μL，再置于体积分数为5%的CO2培养箱内，在37 ℃条件下培养4 h。

2.1.5加DMSO并测定各孔吸光度值取出细胞培养板，弃去MTT溶液。每孔加入DMSO 100 μL，混匀。用酶联免疫检测仪在570 nm处测各孔的OD值，根据如下公式计算抑制率[4]：抑制率=(1-加药组OD值/对照组OD值)×100%。以药物浓度为X轴、抑制率为Y轴绘制抑制率随药物浓度变化的曲线图。

2.2对人肺癌A549细胞迁移的影响

2.2.1消化细胞并计数将处于对数期的人肺癌A549细胞用胰蛋白酶消化后，离心。加入DMEM完全培养液，吹打成单细胞悬液。使用细胞计数板计数。

2.2.2调整细胞浓度将细胞接种于6孔细胞培养板中，根据需要稀释细胞浓度，每孔约5×105个细胞。置于体积分数为5%的CO2培养箱中，在37 ℃条件下培养。

2.2.3划痕并加药待细胞铺满6孔板，用20 μL移液枪头呈“一”字划痕，弃去各孔内培养基，然后用PBS缓冲液洗细胞3次，以去除划下的细胞。设置对照孔和加药孔，对照孔加入体积分数为2%的血清培养基200 μL，加药孔每孔加入含2 g/L狼毒水煎液、体积分数为2%的血清培养基200 μL。每组设置4个复孔，置于体积分数为5%的CO2培养箱中，在37 ℃条件下培养。

2.2.4取样拍照按0 h、24 h、48 h取样拍照，观察细胞的凋亡及迁移情况[5]。

3结果

3.1对人肺癌A549细胞增殖的影响

经酶联免疫检测仪测得：给药组OD值明显较对照组OD值小，在显微镜下可见有部分细胞凋亡；随着药物浓度增大，给药组的OD值有变小的趋势，即狼毒水煎液对A549细胞增殖的抑制作用与其浓度呈正相关。结果见表1、图1。

表1　狼毒水煎液对人肺癌A549细胞增殖的影响

3.2对人肺癌A549细胞迁移的影响

0 h、24 h、48 h分别在倒置显微镜下观察并拍照，与对照组比较，给药组细胞凋亡细胞数明显较多，同一时间点的照片中可见给药组无细胞区域比对照组宽，且无细胞区域的宽度随给药时间的延长而减小。结果见图2。

4结论

通过MTT实验探究了狼毒水煎液对人肺癌A549细胞增殖作用影响，发现狼毒水煎液对人肺癌A549细胞的增殖产生了一定的抑制作用，且抑制率与药物浓度呈正相关；通过划痕实验证明了狼毒水煎液抑制人肺癌A549细胞迁移并且可诱导细胞凋亡的作用，从而说明了狼毒水煎液对人非小细胞型肺癌的抑制作用。

5讨论

肿瘤细胞的无限增殖是肿瘤细胞的最重要生物学特征之一，也是危及癌症患者生命的主要原因之一。同时，细胞增殖调控的异常是诱发肿瘤的重要原因。肺癌转移给人们带来的危害非常大，主要表现为脑转移、骨转移和肝转移。病灶进一步扩大，引起血压降低、瘫痪、呼吸困难、精神错乱、心律失常等，使患者的生命受到威胁，进一步增加了患者的痛苦。因此，抑制肺癌的转移是治疗肺癌的重要目的之一。

图1　狼毒水煎液对人肺癌A549细胞的抑制率

图2　狼毒水煎液对人肺癌A549细胞迁移情况

一直以来，在癌症的治疗方面，手术切除以及放化疗起到了重要作用，但是，这些传统的治疗方法并不能达到彻底清除肿瘤细胞和避免肿瘤转移而有效地控制癌症的目的，同时，手术给患者带来的痛苦和创伤以及放化疗对骨髓、肝、肾等重要器官产生的毒性作用，使得患者的机体免疫力有一定程度的降低，可能不仅不能延长患者的寿命，甚至造成患者寿命缩短或死亡。而与传统的化疗药相比，中药取材方便，医疗费用低，毒副作用小，并且可以不同程度地提高人体免疫力，改善人体内环境，患者痛苦较小，所以，中药抗肿瘤作用的研究已成为当今医学的研究热点。

中药通过多靶点、多环节、多途径实现抗肿瘤作用，可通过调节机体免疫功能，促进细胞分化，诱导细胞凋亡等来抑制肿瘤的发展[6]。

综上所述，狼毒水煎液对人非小细胞型肺癌有一定的抑制作用，可以抑制肺癌细胞的增殖和迁移，并且可以诱导癌细胞凋亡[7-8]，为非小细胞型肺癌的治疗提供了一定的临床指导。

参考文献：

[1] 郭建辉. 中医药治疗肺癌现状分析[J]. 中医学报，2012,27(166):283-285.

[2] 王敏，王学习，贾正平，等. 瑞香狼毒总生物碱的抗肿瘤活性和机理研究[J]. 中草药，2010,33(12):1919-1920.

[3] 杨柯，张京玲，黄谦，等. 狼毒水提液对人A549肺癌细胞凋亡的影响[J]. 实用中西医结合临床，2011,11(5):88.

[4] 徐栋. 和厚朴酚逆转P-gp介导的肿瘤多药耐药及协同、增敏化疗药物杀伤肿瘤细胞的体内外药效研究[D]. 杭州：浙江大学，2007.

[5] 潘兵. 钙调剂拮抗素EBB抑制人肿瘤细胞侵袭迁移的体外实验研究[D]. 北京：中国协和医科大学，2005.

[6] 尹龙，徐亮，胡格，等. 抗肿瘤中药及其有效成分的作用研究现状[J]. 动物医学进展，2006,27(1):39-43.

[7] Wang L, Duan Y, Wang Y, et al. Inhibitory effects of Lang-du extract on the in vitro and in vivo growth of melanoma cells and its molecular mechanisms of action[J]. Cytotechnology, 2010,62(4):357-366.

[8] Huamao Yuan. Preparation, structural characterization and in vitro antitumor activity of kappa-carrageenan oligosaccharide fraction from Kappaphycus striatum[J]. Journal of Applied Phycology, 2005,17(1):241.

[责任编辑时 红]

Effect of Euphorbia decoction on proliferation and migration in A549 cells

Intitute of Pharmacy, Pharmaceutical College of Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

Abstract:〔Objective〕To do a study of Euphorbia decoction on proliferation and migration in A549 cells. 〔Methods〕The effect on proliferation of lung cancer A549 cells is determined by MTT drugs,and the influence on migration of lung cancer A549 cells is determined by the scratch experiment. 〔Results〕Compared with the control group,there is different degrees of inhibition of A549 cells’ proliferation and migration in experimental group;it is a positive correlation between the inhibition effect and the concentration of Euphorbia decoction. 〔Conclusion〕Euphorbia decoction can inhibit non-small cell lung cancer.

Key words:euphorbia; decoction;A549 cells; proliferation; migration

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

作者简介：孟明静(1995-)，女，河南台前人，硕士研究生，从事中药抗肿瘤药理学研究工作。 通信作者：杜钢军(1971-)，男，河南开封人，博士，教授，从事中药抗肿瘤药理学的研究工作。

基金项目：国家自然科学基金项目(81173094)；河南省高校青年骨干教师项目(2010GGJS-025)

收稿日期：2015-09-12

文章编号：1672-7606(2016)01-0001-04