氯化钠溶液对微量血氟电极法测定的影响

周　洲，王红梅，张　晗，贺红，，韩　梅，陈艳卿

(1.中国环境科学研究院，北京 100012；2.中央民族大学，北京 100081)



氯化钠溶液对微量血氟电极法测定的影响

周洲1，王红梅1，张晗2，贺红1，2，韩梅1，陈艳卿1

(1.中国环境科学研究院，北京 100012；2.中央民族大学，北京 100081)

摘要：将加标血清样本与总离子强度调整液(TISAB)1∶1体积混合后加入不同浓度的NaCl饱和溶液，测定血清氟含量。结果显示对不同的生物血清样本，NaCl饱和溶液添加量对氟离子选择电极测定影响程度不同；微量小牛血清样本氟含量测定时NaCl饱和溶液的最佳加入量为20μL；大鼠血清样本氟含量测定时NaCl饱和溶液的最佳加入量为40 μL。运用此方法分别对标准添加的小牛血清和大鼠血清进行测定，结果显示该方法简便、快速，准确度和精密度均达到分析要求。

关键词：微量血清；血氟；氟电极测量；NaCl饱和溶液

氟元素为人体必需的微量元素之一。适量的氟能帮助牙齿和骨骼的正常健康发育，但是过量的氟摄入会导致氟斑牙及氟骨病等地氟病的发生。地氟病是我国许多地区严重的公共卫生问题之一[1,2]。人体(或其它动物)血、尿样本中氟离子的蓄积水平是衡量一个地区人群摄氟量水平和地方性氟中毒监测和防治效果的重要指标和依据[3,4]。对血清样本氟蓄积水平的研究成为环境、食品与环境管理部门的科研热点。相比工业含氟废水或其它环境样本而言，血清样本量十分有限，通常<5mL。如何科学地对微量血清氟进行测定，直接影响氟内暴露分析的准确性。

氟离子选择电极法、离子色谱法和分光光度法是最常见的血氟测定方法。其中氟离子选择电极法是测定溶液中氟离子最典型的方法，在我国氟化物检测标准中均有应用[5,6]。氟离子选择电极法有结构简单牢固、元件灵巧、灵敏度高、响应速度快、能克服色泽干扰以及精密度高等优点[7,8]，在人群调查及动物实验模型血氟检测中被广泛应用[9,10]。

然而，电极法检测时样本量一般在4～5 mL，将其应用到微量血清样本仍缺少方法探索；且不同生物样本血清测定时由于含有不同离子及蛋白的干扰，导致测定时会存在离子活度被干扰，仪器读数不稳定，上下跳动的现象。添加氯化钠饱和溶液有助于提高离子活度，但对不同生物样本测定时如何选择添加量尚缺少系统研究。

本课题立足于氟离子选择电极测定微量血清样本的方法探索，并就NaCl饱和溶液添加量进行讨论，确定最佳添加量使分析结果的准确度和灵敏度得到优化。

1材料和方法

1.1仪器

离子计：上海仪电科学仪器，PXS-270；

氟离子选择电极：上海仪电科学仪器，雷磁PF-2-01；

震荡机：其林贝尔仪器制造，GL-901；

移液枪：eppendorf公司制造，(1mL)、 ppetman公司制造，(100μL)。

实验所有器皿均用去离子水清洗干净，烘干备用。

1.2试剂

氟化钠(高级纯)，冰乙酸(优级纯)，氯化钠(优级纯)，氢氧化钠(优级纯)，国药集团化学试剂公司。EDTA(优级纯)，AMERSCO试剂公司。小牛血清，Sigma P7794。大鼠血清, Equitech-Bio RTS-0050。

TISAB：称取270g 柠檬酸三钠和24g柠檬酸水，用水溶解，移至1000mL容量瓶中，加水稀释至1000mL刻度线，摇匀。

NaCl饱和溶液：向100mL去离子水中溶解NaCl晶体，至溶液中存在不溶晶体。

氟化物标准贮备液：称取已于105 ℃烘干2h的优级纯氟化钠(NaF)0.2210g溶于去离子水中，移入1000mL量瓶中，稀释至标线，混匀贮于聚乙烯瓶中备用，此溶液100mg/L。

氟化物标准使用液:吸取氟化物标准贮备液10.00mL，移入100mL容量瓶，用去离子水稀释至标线，贮于聚乙烯瓶中，此溶液浓度10mg/L。

1.3测定样品制备

将购买的标准小牛血清血样和大鼠血样从冰箱中取出，放置恢复至室温后，充分摇匀，作为模拟血清样本。

1.4仪器操作条件

仪器操作温度为25 ℃，测定时使用的参比电极中饱和氯化钾溶液充足，距离加液口2～3mm，电极测量前用去离子水冲洗拭干。

1.5实验方法

实验使用2.0mL有刻度塑料离心管，按预先设定好的浓度梯度0.05、0.10、 0.20、0.40、0.80和1.00μg/mL移取氟化钠标准使用液，每一浓度梯度制备6个样本，分别用以探索不同氯化钠加入量对氟离子选择电极法测定的影响，氯化钠饱和溶液探索加入量为0.0、10.0、20.0、30.0、40.0和50.0μL。每个测量样本血清及TISAB溶液具体加入量见表1，最后用去离子水定容至1.0mL测量。

1.6样品测定

按照设定好的药剂加入量配制好样本，共72个样本，在振荡机上充分震荡均匀，按从低浓度到高浓度顺序测定。

2实验结果与讨论

2.1氟离子浓度的影响

将不同浓度(0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL和1.00μg/mL)的标样分别加入小牛血清及大鼠血清中，然后加入10、20、30、40、50μL 的NaCl饱和溶液，各样本最终测定总体积为1mL，将最终体积的样本转入微量塑料杯中。雷磁氟电极提前打开，以二次去离子水淋洗后拭干，直接浸入溶液中进行测定。

记录不同氯化钠加入量时测定的电压值，总结氯化钠加入量与电压之间的结果，见图1。

表1　样本药剂加入量一览表

从图1 a中可知，在小牛血清标样中，不同氟离子浓度样本稳定电压读数对应的NaCl饱和溶液添加量范围不同。 0.05μg/mL 氟离子浓度水平在20～40μL范围内保持读数稳定，0.10μg/mL 氟离子浓度水平的样本在20～40μL的NaCl饱和溶液加入量保持读数稳定,0.20μg/mL 氟离子浓度水平的样本在10～30μL的NaCl饱和溶液加入量保持读数稳定， 0.40及0.80μg/mL氟离子浓度水平的小牛血清样本均在20～50μL的NaCl饱和溶液加入读数保持稳定，1.00μg/mL氟离子浓度水平的样本在20～40μL的NaCl饱和溶液加入量保持读数稳定。对氯化钠加入量的选择依据应该为尽量使电压值低，因为这样测定结果可以快速达到稳定，重现性好；同时在不同浓度的氟含量样本中，读数稳定对应的氯化钠加入量应选择相同范围，保证不同浓度样本测定结果精确度一致。

因此，分析小牛血清NaCl饱和溶液加入量示意图1 a，图中阴影Ⅰ区为NaCl饱和溶液的最佳加入量，即为20～40μL，也就是说小牛血清的测定最佳加入量为20～40μL时，样本的测定快速稳定、重现性好，且精确度可在不同浓度样本内达到一致。

从图2b中可知，不同于小牛血清，NaCl饱和溶液加入量对大鼠血清样本读数波动影响与氟浓度相关，0.05和0.20μg/mL氟离子浓度水平在20～40 μL范围内保持读数稳定，0.10μg/mL氟离子浓度水平的样本是在30～50μL的NaCl饱和溶液加入量保持读数稳定，其余氟离浓度子的血清样本均在NaCl饱和溶液加入量为0～20，40μL时读数不变。

与小牛血清相同的选择原则，目的是要保证样本读数快速稳定、重现性好及不同浓度样本测定结果的精确度一致。因此，分析大鼠血清NaCl饱和溶液加入量示意图，图中阴影Ⅰ和Ⅱ区为NaCl饱和溶液的最佳加入量，即为20及40μL，此加入量时样本的测定快速稳定、重现性好，且精确度可在不同浓度样本内达到一致。

2.2对标线的影响

根据NaCl饱和溶液加入量将检测数据分组，分别拟合不同组的标准曲线，拟合曲线及参数见图2，拟合方程式见表2。

NaCl饱和溶液加入量/μL小牛血清大鼠血清0y=42.755x+62.657y=44.47x+58.81910y=41.535x+70.587y=45.106x+48.06220y=48.796x+33.46y=48.463x+32.74530y=48.692x+34.63y=48.566x+32.57440y=48.108x+37.803y=47.524x+37.97550y=47.51x+43.109y=46.378x+43.546

从图2a及表2可知， NaCl饱和溶液加入量会影响小牛血清氟标线的拟合。6组标线拟合方程系数各不相同，其中当NaCl饱和溶液加入量为20μL时，R2值均为0.9954，该组标线的拟合程度最好，且标线方程各系数一致，表示检测样本离子活度稳定；当加入量为50μL时，R2值为0.9866，标线拟合程度最差，其余4组标线拟合程度相差不大。

以标线的拟合程度及标线方程的重现性作为氯化钠加入量的选择依据，图2a及表2所示结果表明，满足选择依据的R2最大值为0.9954，对应的NaCl饱和溶液加入量为20μL，且该组拟合标线系数一致，重现性好。即小牛血清测定时，NaCl饱和溶液加入量为20 μL时标线拟合程度、重现性最好。

从图2b及表2中可知，NaCl饱和溶液加入量对大鼠血清氟标线的拟合影响较小牛血清小，6组标线拟合程度明显优于小牛血清。当NaCl饱和溶液加入量为40μL时，R2值为0.9974，为6组标线中R2数值最高值；当加入量为50μL 时，R2值均为0.9861，R2值最低，方程拟合程度最差。从拟合曲线方程式可以明显看出NaCl饱和溶液加入量为40μL时，拟合方程的重现性好，方程各系数相差较小。

根据标线的拟合程度及标线方程的重现性，图2b及表2所示的结果表明，满足选择依据的R2最大值为0.9974，对应的NaCl饱和溶液加入量为40μL，该剂量的NaCl饱和溶液加入量，标线拟合程度、重现性最好。

2.3方法确定

根据氯化钠加入量的选定原则，在相同浓度的标样测定时，尽量使电压值低，同时在不同浓度的氟含量样本中，读数稳定对应的氯化钠加入量应选择相同范围，同时保证标线的拟合程度最高，标线的重现性好，以保证样本读数快速稳定、重现性好及不同浓度样本测定结果的精确度一致。

在小牛血清中，不同浓度水平的共同稳定读数范围对应的NaCl饱和溶液投加量范围为20～40μL，标线拟合程度最高、标线方程重现性最好对应的NaCl饱和溶液加入量为20μL。所以确定氟离子选择电极测定微量小牛血清样本时，起提高离子活度作用的NaCl饱和溶液最佳加入量为20μL。

与小牛血清相比，NaCl饱和溶液的投加量对不同氟离子浓度水平的微量大鼠血清样本影响不同，共同稳定读数范围对应的NaCl饱和溶液投加量范围为20μL及40μL；而标线拟合时，标线方程重现性最好对应的NaCl饱和溶液加入量范围为40μL。所以确定氟离子选择电极法测定微量大鼠血清样本时，起稳定离子强度作用的NaCl饱和溶液加入量为40μL。

2.4检出限及样本本底值

PF-2-01型氟离子电极的可应用测量范围为1～10-6mol/L，最低检出限为10-6mol/L，即为0.019μg/mL。

平均测定了小牛血清空白溶液(即加氟浓度为0μg/mL)9次，平均电压为331.67mv，相对标准差(RSD)为0.74%，平均含氟量低于仪器检出限，视为未检出；平均测定了大鼠血清空白溶液9次，平均电压为300.56mv，相对标准差(RSD)为0.38 %，平均含氟量为0.1018μg/mL。

2.5精密度与加标回收试验

根据2.3所述确定的NaCl饱和溶液加入量，在相同的氟电极测定条件下，分别用同一小牛血清样本及大鼠样本进行7次重复的测定，测定结果见表3。

结果表明，无论是什么种类的血清，氟离子选择电极法测定微量血清中氟离子的相对标准偏差均<5 %，精密度良好。

在小牛血清及大鼠血清的空白样本中，加入已知量F-标准品，每种血清配成7个已知样品，在相同的氟离子选择电极测定条件下定量分析，计算测得小牛血清样本中F-的平均回收率为100.48%，大鼠血清样本中F-的平均回收率为108.92 %，实验具体结果见表4。

表3　精密度实验结果　(n=7)

表4　加标回收试验结果

2.6注意事项

试验所用的小牛血清样本及大鼠血清样本从-40℃拿出后室温化冻；试验所用的玻璃洗净后，必须使用去离子水润洗3遍，烘干备用；试验过程使用水均为去离子水，防止外源氟离子带入；试验使用样本盛器1.5mL塑料离心管均为一次性使用材料，确保操作过程中无外源氟污染。

3小结

血清氟离子测定基于指示电极端表面的氟化镧单晶膜(掺入微量氟化铕)，单晶膜中氟化铕为2配位，氟化镧为3配位，当大量氟化镧参杂微量氟化铕时，会在单晶膜内形成配位空穴，测定时溶液中的氟离子就会进入单晶膜，进而形成双电层，使得以饱和甘汞电极作参比电极的测量电池电位发生改变，即电池电动势与试液中氟离子活度的对数成正比，一般在1～10-6mol/L范围内符合能斯特方式，基于此原理以测定样本的电动势反推样本的含氟浓度。

在血清氟的测定中，由于不同生物样本血清成份复杂，本底值有差异，实验过程中容易被干扰，存在读数不稳定的问题。通过添加饱和氯化钠溶液增强溶液的离子活度，可以去除其它本底物的干扰。对不同生物血清样本如何加入合适的氯化钠，需要探索。

本课题推荐的探索流程为：①分别确定小牛血清和大鼠血清不同氟浓度时稳定读数对应的氯化钠加入量范围，小牛血清范围为20～40μL，大鼠血清范围为20和40μL;②根据标线拟合程度及标线方程的重现性确定氯化钠加入量范围，小牛血清标线拟合最佳范围为20μL，大鼠血清标线拟合最佳范围为40μL；③综合稳定读数范围和标线拟合最佳范围，确定小牛血清氟离子电极测定时氯化钠最佳加入量为20μL，大鼠血清氯化钠最佳加入量为40μL。

使用确定的方法分别多次测量小牛血清和大鼠血清的空白样本和加标样本。小牛血清的空白样接近仪器的检出限，未检出，RSD为0.74 %；大鼠血清的空白样氟浓度为0.1018μg/mL，RSD为0.38 %。小牛血清加标样本中F-的平均回收率为100.48 %，RSD为4.91 %；大鼠血清样本中F-的平均回收率为108.92 %，RSD为4.49 %。测定结果数据在生物样本检测精确度要求范围内，视为微量血清样本的氟离子选择电极测定方法的准确度和精确度保持在一个较高水平，且方法操作简单易行，数据收集快速精确。可在人群流病调研或动物模拟暴露实验中推广使用，解决血清样本多、量少带来的检测时间长、检测方法限制的问题。

参考文献：

[1]黎昌健, 蒙衍强, 蒋才武. 地氟病在中国大陆的流行现状[J].实用预防医学, 2008, 15(4):1295-1301.

[2]涂俊, 刘克俭, 李明峰, 等. 职业性氟接触人群血氟、尿氟水平及相关因素研究[J]. 中国工业医学杂志, 2010,23(3):163-167.

[3]问县芳, 习海玲, 陈立坤, 等. 氟离子选择电极法的可靠性研究[J]. 公共安全中的化学问题研究进展, 2011(2): 818-822.

[4]李建国, 李菊梅. 氟离子选择电极法在测试中应注意的问题[J]. 分析试验室, 2001, 20(1)：97-98.

[5]王婵娟， 单可人，刘艳洁，等. 毕节市人群乙肝感染状况及血氟含量检测[J].中国公共卫生, 2009, 25(8)：1001-1002.s

Research on the Impacts of Addition of Sodium Chloride on Fluoride in Micor-volume Serum Samples by Fluoride Ion Selective Electrode

ZHOU Zhou1, WANG Hong-mei1, ZHANG Han1, HE Hong1,2,HAN Mei1, CHEN Yan-qing1

(1.Department of Environment and Health, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012 ,China)

Abstract：Trace serum samples were diluted to 1 times by the total ionic strength adjustment buffer (TISAB) and added the standard sodium fluoride and different amount of NaCl saturated solution. The results showed that the effects by NaCl addition were different in different biological serum samples due to different background values. For calf serum sample, the optimal amount of NaCl saturated solution was 20 μL, while the optimal amount of NaCl saturated solution was 40 μL in rat serum samples. The serums from calf and rat added by the known addition standards have been measured. The relative standard deviation (RSD) was 4.91 % with the scope of recovery rates ranged from 90.72 % to 104.52 % in calf serum sample. Meanwhile, the relative standard deviation (RSD) in rat serum sample was 4.49 % with the recovery rates ranged from 97.11 % to 104.52 %.

Key words：trace serum; fluoride; fluoride ion selective electrode method; NaCl saturated solution

收稿日期：2015-09-14

基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务专项(2012-YSKY-01)支持。

作者简介：周洲(1990-)，女，在读研究生，主要研究方向为环境污染与健康。通讯作者：王红梅(1971-)，女，博士，研究员，导师，主要从事环境毒理与风险评估研究。

中图分类号：X83

文献标志码：A

文章编号：1673-9655(2016)02-0095-05