盐溶蛋白电泳和SSR标记鉴定苏玉20种子纯度的比较研究

王波+彭宏+罗绪标+郭玲

摘要： 为建立一套经济、快速、准确鉴定苏玉20纯度的方法，利用盐溶蛋白电泳和SSR标记同时对该品种进行了纯度鉴定，并对2种方法及结果进行了比较分析。研究发现，同一批次种子，2种方法纯度结果基本一致，但盐溶蛋白电泳法纯度结果比SSR分析结果平均高0.78百分点。经综合分析，在实际操作中，建议用SSR标记，利用1～2对引物即可完成苏玉20 的纯度鉴定，其结果更真实准确。

关键词： 玉米种子；苏玉20；盐溶蛋白；SSR标记；纯度鉴定

中图分类号： S513.037 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）03-0072-02

盐溶蛋白电泳一直是种子企业鉴定玉米种子纯度的主要方法之一。该方法简单、便于操作，对技术人员和检验设备要求不高，一般的种子企业检验室都可开展该项工作，因此在实际检验工作中被广泛应用。包和平等利用玉米盐溶蛋白PAGE法和田间小区种植鉴定法对吉林省生产商应用的16个杂交玉米种子纯度进行测定，试验表明，同一样品种子纯度田间小区鉴定普遍高于蛋白PAGE法鉴定纯度值，纯度越高2种方法所测值偏差越小[1]。郭景伦等将玉米杂交种子纯度室内鉴定结果与田间种植鉴定结果进行了对比研究，结果表明，2种方法鉴定结果较吻合，一般相差在5.0%以内，并且玉米种子纯度越高，室内鉴定结果和田间鉴定结果相差越小；纯度越低，2个结果差异越大[2]。

但盐溶蛋白PAGE法有一定的局限性，有些品种双亲蛋白质水平上的差异较小，难以鉴定；鉴定大批量玉米种子纯度时，药品配制量大且步骤繁琐，有些试剂容易失效；另外盐溶蛋白的电泳谱带分辨率低，有时会出现误读或谱带难以辨别，因此对结果判定有一定的影响。近几年来随着SSR分子标记的发展和应用，表现其独特的优越性。孟庆长等以苏玉20杂交种及其亲本为材料，筛选出在苏玉20双亲之间多态性明显、重复性较好的4对引物bnlg1306、phi065、bnlg2291和umc1590用于苏玉20鉴定[3]。此标记特异性好，田间鉴定与利用SSR标记鉴定结果高度一致。本试验利用孟庆长等筛选的4对引物，结合盐溶蛋白电泳法对苏玉20种子纯度进行鉴定，并比较分析，验证2种试验结果的相关性，以便建立一套适应苏玉20品种纯度准确、快速鉴定的试验方法。

1 材料与方法

1.1 材料

苏玉20杂交种及其亲本苏951和苏651种子均由江苏明天种业科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 盐溶蛋白电泳法 参照NY/T 449—2001《玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法》。

1.2.2 SSR分子标记 切取少量胚乳，利用碱煮法[4]提取玉米基因组DNA。利用文献[3]中提供的4对引物（表1）用于苏玉20纯度鉴定，所用引物由上海英俊生物工程有限公司合成。PCR反应体系：DNA模板1.0 μL，Super Taq Mix 5.0 μL（上海浦迪生物科技有限公司），ddH2O 3.0 μL，上下游引物（2.0 μmol/L）各0.5 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应在BIO-RAD 5808R型PCR仪上进行。

PCR反应产物在30%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（N，N-亚甲基二丙烯酰胺 ∶丙烯酰胺=1 ∶29）分离1.5 h后，经0.2% AgNO3银染后显色，拍照观察并记录。

2 结果与分析

2.1 盐溶蛋白及SSR分子标记电泳结果参照农业行业标准NY/T 449—2001《玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法》，将待检批次的苏玉20及其父、母本蛋白质上样，电泳并分析（图1）。结果表明：苏玉20及其亲本自交系间存在差异，且杂交种F1代和双亲谱带互补。图1中，有1个泳道的谱带呈偏母本型，可能是母本接受外来花粉造成的混杂，可以确定为非杂交种。这表明盐溶蛋白电泳可用于苏玉20品种纯度鉴定。

利用孟庆长等筛选出的4对引物[3]对苏玉20杂交种及亲本进行扩增，其中引物umc1590经PCR扩增后，F1代图谱出现3条互补带，因此不建议作为区分此品种的首选引物。而引物bnlg1306、phi065、bnlg2291经PCR扩增后父母本各为1条带，杂交种为双亲的2条互补带，可很好地区分（图2）。

2.2 2种方法的结果比较

对10个不同批次种子同时用2种方法进行对比（表2），研究发现，同一批次种子，蛋白电泳纯度数值比SSR分子标记数值高平均0.78百分点，差异范围在-0.8～3.1百分点。2种方法数值有一定的相关性，种子纯度越高，2种方法数值越接近，如果纯度越低，SSR分子标记数值相对越低。

为进一步验证筛选出的3对引物能否很好地鉴定品种纯度，每一粒种子经玉米单粒磨碎仪研磨后，取少许胚乳做DNA模板，对应的种胚做盐溶蛋白电泳。经比较，2种方法的纯度结果基本吻合（表3）。另外研究发现，152个检测样品，4个母本自交系种子在不同引物标记及蛋白电泳检测中表现均一致，而经phi065检测显示为父本的个体在其他方法中显示为F1代，经bnlg1306和蛋白电泳检测显示为杂株的个体在其他检测方法中显示为F1代。这种现象可能和玉米种子在不同发育时期蛋白表达不同有关。同时也说明在实际工作中，应结合该批种子是自交苗、回交苗、其他类型杂株还是遗传不稳定因素，根据实际情况，选择合适的引物对，对各单株检测结果进行综合判定，确定待测杂交种的纯度。

3 讨论与结论

刘宏魁等利用盐溶蛋白PAGE法和SSR分子标记对先玉335和泽玉11指纹图谱进行了分析，研究发现，盐溶蛋白法可大批量用于纯度检测，对于难以鉴定的品种可用SSR分子标记法作为辅助手段进行鉴定[5]。本试验以同一玉米种子为材料，提取不同取样部位的基因组DNA，利用SSR分子标记法和盐溶蛋白电泳法对苏玉20纯度进行了鉴定，结果表明2种方法均可区分亲本自交系和杂交种。这说明碱煮法适于苏玉20的提取，盐溶蛋白电泳法也可以用于此品种的纯度鉴定。

试验中利用3对SSR引物和蛋白电泳进行比较（表3），研究发现2种方法结果比较吻合。但各个引物的SSR标记图谱和蛋白电泳图谱个别个体表现并非一一对应，这正解释了SSR标记作为一种随机DNA标记，个体在不同引物间存在一定差异，而SSR 标记和盐溶蛋白法个体的差异表现正说明蛋白质电泳图谱易受种子（或幼苗）发育阶段及表达器官的影响，不够稳定从而影响了鉴定结果的准确性。这和赵久然的研究结果[6]是一致的。

参考文献：

[1]包和平，曹丽娟，杨 光. 用盐溶蛋白PAGE法检测杂交玉米种子纯度[J]. 中国种业，2006（6）：36-37.

[2]郭景伦，赵久然，王风格，等. 玉米杂交种纯度室内与田间鉴定结果比较研究[J]. 种子世界，2004（7）：22-24.

[3]孟庆长，陈艳萍，杨兴华，等. 利用SSR技术鉴定苏玉20的纯度[J]. 江苏农业学报，2009，25（3）：508-512.

[4]王建华，田宝华，杨丽维，等. 玉米单粒播种子质量评价与检测技术手册[M]. 北京：中国农业大学种子科学与技术研究中心，46-52.

[5]刘宏魁，闫洪朗，原亚萍. 应用盐溶蛋白电泳和SSR分子标记鉴定玉米种子纯度的研究[J]. 安徽农业科学，2011，39（19）：11396-11398.

[6]赵久然. 玉米种子真实性和品种纯度鉴定新方法[J]. 北京农业科学，1999（3）：25-40.