水稻剑叶角度qFla-8-2位点的精细定位

朱长丰　梁利君　曾思远　李天伟　董冠杉　洪德林

(南京农业大学 作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095；*通讯联系人，E-mail: delinhong@njau.edu.cn)



水稻剑叶角度qFla-8-2位点的精细定位

朱长丰梁利君曾思远李天伟董冠杉洪德林*

(南京农业大学 作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095；*通讯联系人，E-mail: delinhong@njau.edu.cn)

朱长丰, 梁利君, 曾思远, 等.水稻剑叶角度qFla-8-2位点的精细定位. 中国水稻科学， 2016， 30(1)： 27-34.

摘要:为更好地理解水稻大剑叶角的分子遗传机制，对已初定位的控制剑叶角度的qFla-8进行精细定位和候选基因预测。利用以863B为受体亲本、A7444为供体亲本衍生的BC3F3群体中仅在目标基因区段杂合的172个单株自交构建的次级分离群体，对qFla-8所在的RM6215-RM8265区间9个SSR标记的基因型进行鉴定，结合表型数据进一步缩短qFla-8所在染色体区段。结果发现qFla-8位点所在染色体区段存在两个紧密连锁的位点qFla-8-1和qFla-8-2。其中，qFla-8-1位于RM6215和RM3153之间，可解释22.33%的表型变异；qFla-8-2位于RM1309和RM3491之间，可解释23.81%的表型变异。进一步对加性效应较大的qFla-8-2精细定位，通过开发插入缺失(InDel)分子标记，将qFla-8-2位点限定于InDel标记Z7和SSR标记RM23071之间，该区间的物理距离为67 kb。该区段包含3个预测基因Os08g0408200,Os08g0408300和Os08g0408500，分别编码功能类似GAMYB的WD40结构域蛋白、假定蛋白以及类APETALA2蛋白。

关键词:水稻； 剑叶角度； QTL； 精细定位

水稻剑叶角度是指剑叶与穗颈之间的夹角，是水稻株型的重要组成因素之一。在水稻生产上，一般认为剑叶角度小的直立型叶可以提高光合能力，增加籽粒充实度，对提高产量有利[1]。但在杂交稻制种过程中，需要人工赶粉提高不育系的异交结实率，剑叶角度小的上举叶不利于田间不育系辅助授粉[2]。为此，在杂交稻制种过程中要将不育系的剑叶顶部1/3或1/2割去。该环节不仅劳动强度大，而且需要较高的操作技术，否则会割到正在抽出的幼穗。同时，割叶造成的伤口对水稻植株的正常生长亦有不利影响。因此，培育出水稻大剑叶角度(≥90°)的不育系，既可免去制种田人工割叶，又可为加快实现杂交稻制种全程机械化提供便利。

经典遗传学研究表明，水稻的剑叶角度受一对主基因和多对微效基因控制，小角对大角有部分显性作用[3]。迄今为止，利用分子标记已鉴定出57个与剑叶角度相关的QTL，分布于水稻第10染色体之外的11条染色体上。第1至第9染色体上分别有9、6、6、4、6、6、6、4、4个，第11和12染色体上各有3个，这些QTL的贡献率为4.49%～14.60%[4-12]。汪得凯等[13]从T-DNA插入转基因株系的水稻突变体库中分离得到一个所有叶角增大的突变体lla，并克隆了控制大叶角性状的基因OsWRKY11。然而，除文献[10]和[12]外，上述这些研究所使用的双亲(或突变体与野生型)之间的剑叶角度差异较小(7.58°～42.75°)，剑叶仍是上举的，不适于杂交稻制种中大剑叶角度不育系的培育。此外，成株期所有叶角偏大的植株可能不利于光合作用。

汪得凯等[13]和金伟栋等[14]在研究太湖流域粳稻地方品种资源多样性的过程中，发现了一个具有特大剑叶角度(约150°)的粳稻品种A7444，表现为剑叶下伸，其余叶片均上举，年度间性状稳定[14-15]。利用863B/A7444//863B组合的BC1F1群体，检测出4个控制剑叶角度的QTL[12]。根据初定位结果，利用分子标记辅助选择(MAS)技术构建了以863B为遗传背景、包含A7444qFla-2和qFla-8位点染色体片段近等基因系在内的回交重组自交系群体[16]。本研究的目的是：1)精细定位qFla-8，提供与其紧密连锁的两侧标记，为通过MAS改良不育系的剑叶角度服务；2)筛选候选基因，为大剑叶角度等位基因的克隆、功能分析以及最终阐明这一农艺性状的遗传代谢机理奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为小剑叶角度的粳稻保持系863B、大剑叶角度的太湖粳糯稻地方品种A7444，以及863B为受体亲本、A7444为供体亲本衍生的BC3F3群体目标基因区段杂合的单株自交产生的次级分离群体。863B是江苏省杂交粳稻审定组合86优8号(苏种审字第363号)的保持系，从孕穗到成熟剑叶角度变幅为10°～30°(图1-A～C的左侧)，A7444是在823份太湖水稻地方品种资源中发现的粳糯稻品种，从孕穗到成熟剑叶角度变幅为120°～160°(图1-A～C的右侧)。

1.2田间种植与目标单株鉴定

863B、A7444和863B/A7444//863B组合的BC3F3群体的84个株系于2013年5月10日播种，6月11日移栽。863B和A7444各栽10行，84个株系各栽3行，每行8株。分蘖期利用SSR分子标记鉴定84个株系中各单株的标记基因型，从中筛选出仅在RM6215-RM8265区间段标记基因型分离的8个株系用于进一步定位。根据进一步定位结果，鉴定目标染色体区段杂合而其余区段均纯合的863B基因型的大剑叶角度单株(图1-C， CF14-3)。成熟期收获68个目标单株的自交种子(次级F2种子)。次级F2分离群体于2014年5月12日播种，6月16日移栽。次级 F2分离群体正常生长发育株数为4539。所有供试材料均种植于南京农业大学江浦试验站水稻试验田。单本栽插，株距16.7 cm，行距20.0 cm。常规田间管理。

1.3性状调查

剑叶角度测量方法：始穗期选取目标单株的主茎穗(最高穗)，用量角器测量水稻剑叶叶片与穗轴之间的夹角(图2)。863B和A7444各测量10株，以10株的平均值作为表型观察值；分离群体以单株测量值作为表型观察值。

1.4DNA提取和PCR扩增

DNA提取采用Dellaporta等[17]的方法。

PCR扩增采用10 μL反应体系：DNA工作液1.0 μL，引物(2 pmol/μL)0.7 μL，10×缓冲液(无 MgCl2)1.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.2 μL，MgCl2(25 mmol/L)0.6 μL，Taq酶(5 U/μL)0.1 μL，ddH2O 6.4 μL。PCR反应程序如下：95°C下预变性5 min；95°C下变性30 s，50°C～65°C退火30 s，72°C下延长1 min，32个循环；最后72°C下延伸7 min。

电泳后的聚丙烯酰胺凝胶先用固定液(10%的酒精，0.5%的冰乙酸)固定10 min，ddH2O清洗两次；再用0.2%的AgNO3溶液染色10 min，ddH2O清洗两次；最后加入显色液(1.5%的NaOH溶液，1%的甲醛)显色，条带清晰后终止显色反应，用数码相机拍照并记录实验结果。

1.5SSR标记筛选和InDel标记开发

SSR标记筛选：在公布的微卫星数据库(http://www.gramene.org/microsat)中查找初定位RM6215-RM8265区间中的引物。

A-863B(左)和A7444(右)孕穗期的剑叶角度，bar=5 cm； B-863B(左)和A7444(右)灌浆期的剑叶角度，bar=10 cm； C-863B(左)、CF14-3(中,863B近等基因系)和A7444(右)成熟期的剑叶角度，bar=10 cm。白色箭头指的是剑叶角度。

A, Flag leaf angle of 863B (left) and A7444 (right) at the booting stage, bar=5 cm; B, Flag leaf angle of 863B (left) and A7444 (right) at the filling stage, bar=10 cm; C, Flag leaf angle of 863B (left), CF14-3 (middle， NIL of 863B) and A7444 (right) at the mature stage, bar=10 cm. Flag leaf angle was showed by the white arrows.

图1863B和A7444不同生育期的剑叶角度

Fig. 1. Flag leaf angle of 863B and A7444 at different growth stages.

图2水稻剑叶角度测量方法(左)及863B和A7444灌浆期剑叶角度(右)

Fig. 2. Measuring method (left) of flag leaf angle and the flag leaf angle of 863B and A7444 at the filling stage (right).

InDel标记开发：比较日本晴和9311基因组的序列差异，在插入或缺失大于10 bp的位点处使用NCBI的在线Primer BLAST程序设计相应的InDel引物(扩增产物大小为100～300 bp)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

SSR引物和InDel引物均由金斯瑞生物科技有限公司(南京)合成。

1.6目标区段缩短和候选基因预测

在BC3F3群体中选择仅qFla-8所在区间(RM6215-RM8265)标记基因型分离的8个株系共172个单株组成了一个小定位群体(POP1, 次级F2群休4539株中的一部分)。根据POP1群体的目标区段9个分子标记信息，利用IciMapping version 4.0软件(www.isbreeding.net/)中的MAP程序构建区段遗传图谱；然后结合POP1群体的剑叶角度表型数据，采用IciMapping version 4.0软件中的完备复合区间作图法进行QTL定位，用以缩短qFla-8位点所在染色体区段。QTL检测时，以3.0为LOD阈值，当估算得到的LOD值高于LOD阈值时即认为在该位置处存在一个QTL，并估算相应的加性效应和贡献率。

表1缩短qFla-8所在区间用到的SSR引物

Table 1. SSR primers used for further narrowing qFla-8 region.

引物名称Primername正向引物(5'-3')Forwardprimer(5'-3')反向引物(5'-3')Reverseprimer(5'-3')产物长度Productionlength/bpRM23021CTCAATGATGTTCTCGGCTTCCGCCACAACGGTCAAGTAAAGAGC200RM6215TTCAGCAGAGAGATGACGCAAGGGTACAAACCAGCCCTCCGAGACG190RM3153GTGTGATGGTGACGGATTACATGTGCCATGCTGCAGAATTTCCATGTTGG402RM3689CGTCAGCCGAAACTACTATCTAAACCGTTTCACTGCACTCTGGTTTGC293RM1309GAGGACACTGACGACAGCTTGGCGCGCAAATCATTAAGTTCAGG186RM3491GTGTTCTGATGTTCCCTCTCTGCCCAACAAGGACTCACATGTCTCG120RM8264TTCTACGGAATTTCTCCCTCTGGCTAATCAATCTCTCGCGTTCTTGG162RM8265TCGGCTGATCTGACCGTACATCCGTGCATGCAACCACCTCTTGG185RM5808GGGAGTAGGAGGGAGGGAGAAAGAGGCAGAACCAGCGAGGGAAACACC112

在对目标区间进行标记加密后，根据目标基因位点与分子标记之间重组体单株数目，最终确定与目标基因位点紧密连锁的两侧分子标记。通过查找NCBI数据库，将两侧分子标记锚定于日本晴的具体染色体基因组位置，进而预测候选基因。

2结果与分析

2.1qFla-8所在染色体区段存在两个紧密连锁的位点

利用POP1群体进一步缩小控制剑叶角度qFla-8的标记区间。为了确保qFla-8位点在检测区间中，对完全包含RM6215-RM8265区间的RM23021-RM5808区间进行标记加密，利用较均匀分布在此区间的29对SSR引物对863B和A7444进行多态性检测，其中5对SSR引物在亲本之间具有多态性，与RM23021、RM6215、RM8265和RM5808共9对标记被用于qFla-8位点的进一步分析。引物筛选结果如表1所示。

黑色箭头表示qFla-8所在位置。

The black arrow indicatesqFla-8.

图3第8染色体上qFla-8的遗传解析

Fig. 3. Genetic analysis of qFla-8 on chromosome 8.

利用这9对SSR标记分析POP1群体的172个单株，发现在qFla-8位点所在染色体区段内存在两个紧密连锁的位点(图3)，分别命名为qFla-8-1和qFla-8-2。qFla-8-1位于SSR标记RM6215和RM3153之间，可解释22.33%的表型变异，增效等位基因来源于863B；qFla-8-2位于SSR标记RM1309和RM3491之间，可解释23.81%的表型变异，增效等位基因来源于A7444。qFla-8-1所在区间段的物理距离是76 kb，qFla-8-2所在区间段的物理距离是460 kb。

2.2qFla-8-2的遗传分析和精细定位

从qFla-8-2 单位点分离群体(4539株)中选取438株具有极大剑叶角度的单株(≥90°)，利用qFla-8-2的两侧标记RM1309和RM3491分析这438个单株的标记基因型，在这两个标记处共筛选到21个重组体单株，其中RM1309和qFla-8-2之间有13个重组体单株，而RM3491和qFla-8-2之间有8个重组体单株。进一步对RM1309-RM3491区间进行标记加密，通过查询SSR引物数据库，发现该区间存在12对SSR引物(引物名称及序列未列出)，其中仅有2对SSR引物在863B和A7444间呈现多态；为此新开发了35对InDel引物，同样只有2对在亲本间有多态(表2)。利用这4个标记分别对21个重组体单株进行分析，结果表明RM23065和qFla-8-2之间有12个交换，Z5和qFla-8-2之间有9个交换，Z7和qFla-8-2之间有5个交换，RM23071和qFla-8-2之间有4个交换。因此，qFla-8-2位点被限定在InDel标记Z7和SSR标记RM23071之间，其间物理距离为67 kb(图5-A)。

图4单位点qFla-8-2 F2分离群体163个单株的剑叶角度分布

Fig. 4. Frequency distributions of the flag leaf angle of 163 plants in F2segregating generation of qFla-8-2 locus.

2.3 67 kb区间候选基因

基于日本晴序列的基因组注释数据库(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的序列预测信息，在精细定位的67 kb基因组区间内共包含3个候选基因，分别是Os08g0408200，Os08g0408300和Os08g0408500(图5-B)。其中，Os08g0408200含有10个外显子，编码功能类似于GAMYB蛋白的WD40结构域蛋白，在植物生长发育以及细胞信号转导方面具有重要作用；Os08g0408300含有1个外显子，编码一种假定蛋白；Os08g0408500含有1个外显子，编码APETALA2-like protein，在植物的抗逆性方面发挥重要作用。初步认为Os08g0408200是大剑叶角度候选基因。

表2精细定位qFla-8-2所用SSR和InDel标记

Table 2. SSR and InDel markers used for fine mapping of qFla-8-2.

引物名称Primername正向引物(5'-3')Forwardprimer(5'-3')反向引物(5'-3')Reverseprimer(5'-3')产物长度Productionlength/bpRM1309GAGGACACTGACGACAGCTTGGCGCGCAAATCATTAAGTTCAGG189RM23065CCACGAACTCTCCCTATATCTACTGCCGTGCACACCTGAAGAGTATGG135RM23071GTTCCGCCGTTGAGTGATGACCTCCTCAGTCCTCCCTCTCCTTCC287Z5GTCAAATCAGCTGGTTCAGTGATTTGACCTAACGATTGCGA200Z7ATCCACGTCACCCACAACTCCCCACGGAAAACCAAAACAT102RM3491GTGTTCTGATGTTCCCTCTCTGCCCAACAAGGACTCACATGTCTCG266

A-利用438个单株的作图群体对qFla-8-2基因进行的精细定位。黑色水平线下面的数字表示标记与基因之间的交换单株数。B-qFla-8-2基因最终被缩到67 kb的DNA区段上。粗黑色箭头代表的是预测基因。

A, Fine mapping ofqFla-8-2 genome region using mapping population with 438 plants. Numbers below the black horizontal line represent the numbers of recombinants between the marker and gene. B,qFla-8-2 was finally narrowed to a 67 kb DNA fragment. The thick black arrows mean predicted genes.

图5qFla-8-2的图位克隆

Fig. 5. Map-based cloning of qFla-8-2.

3讨论

3.1与前人研究成果的比较

通过QTL分析将剑叶角度基因qFla-8-2定位于第8染色体长臂靠近着丝点的位置，在InDel标记Z7和SSR标记RM23071之间67 kb的区段上，所在区间的物理图谱为19,579,753 bp～19,644,684 bp。第8染色体上曾报道过3个与剑叶角度相关的QTL，分别位于RM4085-RM1111区间、XNpb187-XNpb56区间和CT195-G1073区间[6,8-9]。第一个标记区间位于第8染色体短臂上，相应的物理图谱为4,472,206 bp～4,772,713 bp；后两个标记区间则位于第8染色体长臂上，相应的物理图谱分别是22,469,139 bp～26,383,574 bp和20,677,675 bp～20,740,799 bp。这3个区间段均没有出现和本研究定位的QTL区段相互交叉的部分，说明qFla-8-2是一个新的控制剑叶角度的基因。

3.2大剑叶角度基因在育种中的应用

将性状作为形态学标记应用于育种中早有报道。如白化转绿突变体ysa成熟后其株高、分蘖数、有效穗长度、结实率等主要农艺性状与野生型没有明显差异，将该白化转绿性状应用到雄性不育系中作为叶色标记，在苗期就可以剔除假的雄性不育株[18]。曹立勇等[19]将叶色标记与不育系相结合，成功培育出中紫S。目前，借助于不断发展的分子标记辅助选择技术，国内外不少研究者开展了水稻剑叶的研究，越来越多的剑叶角度QTL被鉴定出来。但大多数的QTL所控制的剑叶角度都很小，难以应用于杂交稻制种中。本研究的qFla-8-2控制的剑叶角度在苗期、分蘖期与野生型相比并没有表现出典型特征，但从孕穗期开始表现出剑叶下伸。利用与大剑叶角度性状紧密连锁的分子标记进行鉴定，通过回交选育出大剑叶角度的保持系，继而通过回交转育为大剑叶角度的不育系，繁殖制种过程中可以免去割叶的程序，不仅节省繁殖制种劳力成本，而且有利于实现机械化制种，提高效率。由于qFla-8-2位点是隐性，只要制种父本是小剑叶角度，配制的杂种一代的植株剑叶将是上伸的，理论上不会影响杂种一代优势的发挥，但可能会影响保持系的繁殖产量。

3.3叶角的遗传机理

目前，已报道的关于叶角突变的遗传机理主要与激素的生物合成或信号转导有关，相关机理可分为以下三种：一是叶枕近轴端处的细胞延长。如d2突变体，为D2基因缺失型突变体。D2基因编码一种细胞色素P450蛋白，该蛋白属于CYP90超级家族，和拟南芥中参与油菜素内酯合成酶的CPD蛋白具有高度同源性，类似于BR合成酶的作用。通过调控BR的生物合成，增加了叶枕近轴端的细胞长度，使叶角度增大[20]。另一基因ILI1通过过表达功能类似拟南芥PRE1蛋白的一种HLH蛋白，增加了叶枕近轴端处的细胞长度，促进叶片向下弯曲[21]。二是增加叶枕近轴端处的细胞分裂。如位于第2染色体上的lc2基因，通过促进与细胞分裂相关基因的表达，使叶枕近轴端处的细胞快速分裂，从而增大了叶片角度[22]。三是降低叶枕处的机械组织强度。如ila1基因，该基因的表达抑制了细胞分裂素的形成，导致叶枕部位机械组织变小，细胞壁主要成分纤维素和木聚糖的含量下降，叶枕处机械强度下降，导致叶夹角增大[23]。本研究通过精细定位，将控制剑叶角度的qFla-8-2限定于第8染色体InDel标记Z7和SSR标记RM23071之间67 kb的区段上，该区间包含3个预测基因，分别是Os08g0408200,Os08g0408300和Os08g0408500。基因功能注释表明，Os08g0408200基因编码一种WD40结构域蛋白，该蛋白和赤霉素(GA)的转录因子MYB具有相同的功能，在细胞的信号转导方面发挥重要作用，该基因最有可能是候选基因。

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Fine Mapping ofqFla-8-2 for Flag Leaf Angle in Rice

ZHU Chang-feng, LIANG Li-jun, ZENG Si-yuan, LI Tian-wei, DONG Guan-shan, HONG De-lin*

(StateKeyLaboratoryofCropGeneticsandGermplasmEnhancement,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China;*Correspondingauthor,E-mail:delinhong@njau.edu.cn)

ZHU Changfeng, LIANG Lijun, ZENG Siyuan, et al. Fine mapping of locusqFla-8-2 for flag leaf angle in rice. Chin J Rice Sci, 2016, 30(1): 27-34.

Abstract:To better understand the genetic mechanism regulating large rice flag leaf angle, qFla-8 detected previously was further fine-mapped and the candidate genes were predicted. Using a secondary segregating population, composed of 172 selfing individual plants with heterozygous region of target gene merely in BC3F3 population derived from the backcross between 863B (recipient parent) and A7444 (donor parent), genotypes of nine SSR markers in the interval of RM6215-RM8265 containing qFla-8 were identified. Combining the phenotypic data, chromosome segment containing qFla-8 was further narrowed and there are two closely linked loci, qFla-8-1 and qFla-8-2.qFla-8-1 was localized between RM6215 and RM3153, explaining 22.33% of phenotypic variation,and qFla-8-2 was localized between RM1309 and RM3491, explaining 23.81% of phenotypic variation. By developing insertion-deletion (InDel) markers, qFla-8-2 with higher additive effect was finally limited to 67 kb region between InDel marker Z7 and SSR marker RM23071,which contains three predicted genes, Os08g0408200 encoding WD40 domain containing protein similar to GAMYB-binding protein, Os08g0408300 encoding hypothetical protein and Os08g0408500 encoding APETALA2-like protein.

Key words:rice; flag leaf angle; QTL; fine mapping

文章编号:1001-7216(2016)01-0027-08

中图分类号:Q343.1+5; S511.032

文献标识码:A

基金项目:国家863 计划资助项目(2010AA101301)； 高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20130097110001)； 中央高校基本科研业务费专项资金项目(KYZ201202-9)。

收稿日期:2015-06-15； 修改稿收到日期: 2015-08-24。