马唐生防菌厚垣孢镰刀菌ZC201301的生物学特性研究

李健，李岩，高兴祥，房锋，李美*

(1.山东省农业科学院植物保护研究所，山东 济南 250100；2. 济宁市兖州区农业局，山东 济宁 272100)



马唐生防菌厚垣孢镰刀菌ZC201301的生物学特性研究

李健1，李岩2，高兴祥1，房锋1，李美1*

(1.山东省农业科学院植物保护研究所，山东 济南 250100；2. 济宁市兖州区农业局，山东 济宁 272100)

摘要：厚垣孢镰刀菌ZC201301对杂草马唐具有良好的生物防效，本研究通过单次单因子法对菌株ZC201301的基本生物学特性进行了进一步研究。结果表明，菌株ZC201301最适生长培养基为PDA和CAJ培养基，最适生长温度为25～30℃，最适生长pH值为6～8；菌株ZC201301在多种培养基上均能产孢，最适产孢培养基为马唐汁液培养基，日光灯照射对菌丝生长影响不显著，但是对产孢有一定抑制作用；菌丝生长最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为硝酸铵；菌落生长需要充足氧气，气/液小于1∶1时菌丝生长受到抑制。湿度是影响ZC201301发挥生防效果的重要因子，环境湿度小于60%时生防效果下降显著。以上结果说明，该菌适宜培养，这对于其生防菌剂的制备及在田间条件下存活有重要意义。

关键词：马唐；厚垣孢镰刀菌；生物除草剂；生物学特性

马唐(Digitariasanguinalis)是禾本科一年生恶性杂草，广泛分布于热带和温带地区[1]，危害小麦(Triticumaestivum)、大麦(Hordeumvulgare)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)等30多种作物，是世界上分布最为广泛的18种恶性杂草之一[2]。马唐环境适应能力极强，生长期与作物较为一致，易同作物竞争消耗地力[3-4]。近年来，马唐的大量发生对我国黄淮海玉米产量造成了严重影响[5]。目前对于马唐的防治主要是采取化学手段，但是化学药剂的大规模使用不仅对环境和食品安全造成了影响，同时也导致了抗性马唐的产生[6]，这都为马唐的有效防控造成了困难。同时，由化学防控导致的环境污染日趋严重，生物防治及其他非化学防控手段日益受到学者的重视[7]。

马唐的生物防治研究开展较早，国外有报道利用弯孢霉(Curvulariaintermedia)[8]及马唐黑粉菌(Ustilagosynthersmae)[3]作为马唐生防菌剂。海南大学利用新月弯孢霉(Curvularialunata)菌株MT-011[9]，南京农业大学利用画眉草弯孢霉(Curvulariaeragrostidis)[10]，浙江师范大学利用弯孢型炭疽菌(Colletotrichumhanaui)菌株[11]进行了马唐防治研究，均取得一定效果。本研究所用菌株为厚垣孢镰刀菌ZC201301，为本科室前期筛选得到的一株马唐生防菌，前期测定表明该菌种孢子悬浮液喷雾处理对苗期马唐具有非常好的防控效果，马唐感病后很快干枯死亡，同时该菌也可使其他杂草感病，对反枝苋(Amaranthusretroflexus)、狗尾草(Setariaviridis)等杂草表现出一定的防控效果[12]。

优化培养条件以获得最佳生防因子是生防菌应用的前提[13-14]。因此本研究以前期筛选得到的马唐生防菌ZC201301为材料，通过对其多个基本生物学特性进行研究，以明确其最佳培养和产孢条件，为其下一步应用提供依据。

1材料与方法

1.1菌种与培养基

本研究所用菌株为厚垣孢镰刀菌ZC201301(专利公开号：CN104250620A)，2014年由本实验室采集并保存。

本研究所用培养基基本配方如下,马铃薯葡萄糖培养基(PDA):马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水定容至1000 mL；马铃薯蔗糖培养基(PSA):马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，水定容至1000 mL；胡萝卜培养基(CA):胡萝卜200 g，琼脂20 g，水定容至1000 mL；水琼脂培养基(WA):琼脂20 g，水定容至1000 mL；马唐汁液培养基(CAJ):马唐汁液 200 g，琼脂20 g，水定容至1000 mL；1×, 2×, 4×, 10×, 20×CAJ培养基为原始马唐汁液培养基稀释相应倍数。

碳源基础培养基：酵母浸膏1 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，K2HPO41 g，琼脂20 g，水定容至1000 mL；氮源基础培养基：蔗糖20 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，K2HPO41 g，琼脂20 g，水定容至1000 mL。

1.2影响菌株ZC201301菌丝生长及产孢等因子的测定

1.2.1培养基PDA培养基活化保存的菌株，5 d后，在菌落的边缘打取直径为5 mm的菌饼，接种到各供试培养基上，7 d后测量菌落直径；并收集菌丝，80℃烘箱烘烤2 h后称量菌丝干重(下同)；3 mL无菌水清洗菌落表面孢子，收集后血球计数板计数，计算产孢量(下同)。

1.2.2温度共设置 15，20，25，28，30，35℃ 6个处理，参照1.2.1的方法PDA培养基上培养菌株ZC201301，放置于设置为不同温度的培养箱内，接菌后7 d，统计菌落直径和菌丝重量。

1.2.3培养和光照时间以筛选出的PDA和CAJ培养基为产孢培养基，进行不同培养时间对菌株产孢量影响的测定，培养时间设置为接种后2，3，5，7，14 d，收集孢子，分别计算产孢量。以筛选出的产孢量最大的CAJ培养基为产孢培养基，测定光照条件对菌株产孢量的影响，光照条件设置为连续黑暗、连续光照、黑暗/光照交替(8 h/16 h、12 h/12 h、16 h/8 h)5个处理，接菌后7 d，收集孢子，分别计算产孢量。

1.2.4pH值将PDA培养基灭菌后调制成不同pH值，设置的pH值为4，5，6，7，8，9这6个处理，参照1.2.1的方法，25℃，黑暗条件下培养7 d后，统计菌落直径和菌丝重量。

1.2.5碳氮源在碳源基础培养基上分别添加相应量(20 g/L)葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖等5种碳源，观察并统计菌落生长情况；在氮源基础培养基上分别添加相应量(1 g/L)硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、硝酸铵、硫酸铵等5种氮源，25℃，黑暗条件下培养7 d，观察并统计菌落生长情况。

1.2.6气/液以100 mL 液体马铃薯葡萄糖培养基为基础，通过采用不同容积的三角瓶达到气/液体积比为1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶4这4个处理。25℃，150 r/min，黑暗条件下摇菌培养72 h，过滤收集所有菌丝，烘干后称量菌丝重量。以上实验每个处理均设置3个重复。

1.3环境湿度对菌株ZC201301致病力的影响

25℃，黑暗条件下，ZC201301菌株在CAJ培养基上培养7 d后，收集孢子并配制成浓度为1×108个/mL的孢子悬浮液(含0.1%吐温80)。将孢子悬浮液用手持小喷壶喷施于2～3叶期的马唐植株上，黑暗条件下放于不同湿度人工气候箱内；25℃，黑暗培养48 h后持续光照，14 d后称量植株鲜重，计算鲜重抑制率。以喷施0.1%吐温80植株为对照，每处理重复3次。

1.4数据分析

鲜重抑制率(fresh weight inhibition rate，FWIR)的计算公式: FWIR(%)=[(对照平均鲜重-处理平均鲜重)/对照平均鲜重]×100。利用SPSS统计软件ANOVA和GLM分析不同处理间的差异显著性。

2结果与分析

2.1菌株ZC201301在不同培养基内生长和产孢差异

结果(表1)表明，菌株ZC201301在PDA和CAJ培养基上生长速率最高，培养7 d后菌落直径分别达到7.91和7.55 cm，气生菌丝量PDA培养基最多，约为CAJ培养基气生菌丝量的6倍；但最佳产孢培养基为CAJ培养基，培养7 d后其产孢量约为PDA培养基的167倍。

表1　菌株ZC201301在不同培养基上的生长速率和产孢数量

注：表中数值为平均值±标准误(n=3)，同行数据后的不同字母表示在 0.05 水平上差异显著，下同。

Note: The values in the table are the average value of the standard error (n=3), and the different letters within the same row indicate that the difference is significant at the 0.05 level. The same below.

由表1可以看出，菌株ZC201301的最佳产孢培养基为CAJ培养基。为了利用尽量少的培养材料获得较高的分生孢子产量，我们进一步降低CAJ培养基内的马唐数量研究其对产孢的影响，由表2可以看出，CAJ培养基稀释两倍(2×)情况下其产孢量不受影响，而当稀释倍数继续加大，菌株ZC201301的生长和产孢量受到显著影响。

表2　不同马唐含量CAJ培养基上菌株ZC201301的生长速率和产孢数量

2.2培养时间对菌株ZC201301产孢的影响

以PDA和CAJ培养基为产孢培养基，统计不同培养时间内菌株ZC201301的产孢量。由表3可以看出，菌株ZC201301在PDA培养基上产孢较慢，产孢量在培养7 d时基本达到最大量3.3×107个，而该菌株在CAJ培养基上较短时间内就能够产生大量孢子，培养7 d后其产孢量已经达到583.9×107个。

2.3光照时间对产孢量的影响

以CAJ培养基为产孢培养基，研究光照时间长短对菌株ZC201301产孢量的影响。由表4可以看出，连续黑暗条件下产孢量最高，光照对产孢量有一定抑制作用，且随着光照时间的增长抑制作用更为明显；另一方面光照时间的变化对于菌株气生菌丝的生长没有影响。

2.4培养温度对菌株ZC201301生长的影响

由表5可以看出，菌株ZC201301在PDA培养基上的最适生长温度在25～30℃，当培养温度≤20℃和>30℃时生长速率和气生菌丝产生量均受到明显抑制。

2.5pH值对菌株ZC201301生长的影响

由表6可以看出，菌株ZC201301在CAJ培养基上的最适生长pH值为6～8，当培养基pH值<6和>8时生长速率和气生菌丝产生量均受到明显抑制。

表3　不同培养时间菌株ZC201301产孢量

表4　光照时长对菌株ZC201301生长和产孢量的影响

表5　温度对菌株ZC201301生长的影响

表6　pH值对菌株ZC201301生长的影响

表7　不同气/液比值对菌株ZC201301生长的影响

2.6气/液对菌株ZC201301生长的影响

图1　菌株ZC201301在含不同碳氮源培养基上的生长速率Fig.1　Growth rate of strain ZC201301 in different carbon and nitrogen sources　　　A:葡萄糖 Glucose;B:麦芽糖 Maltose;C:可溶性淀粉 Soluble starch;D:乳糖 Lactose;E:蔗糖 Sucrose;F:硝酸钠 NaNO3;G:硝酸钾 KNO3;H:硝酸钙 Ca(NO3)2;I:硫酸铵 (NH4)2SO4;J:硝酸铵 NH4NO3. 不同字母表示在0.05 水平上差异显著(n=3)。Different letters indicate that the difference is significant at the 0.05 level (n=3).

由表7可以看出，菌株ZC201301在气/液为1∶0.5和1∶1时菌丝重量大，而当气/液为1∶2和1∶4时，菌株ZC201301生长受限。

2.7碳氮源对菌株ZC201301生长的影响

由图1可以看出，菌株ZC201301最佳碳源为葡萄糖，但该菌株对碳源的要求不严格，在不同碳源培养基上生长差异不显著；最佳氮源为硫酸铵，其对铵态氮源的利用好于硝态氮源。

2.8接种环境湿度对菌株ZC201301致病力的影响

湿度是限制菌株ZC201301发挥生防功能的重要限制因子。由表8可以看出，菌株ZC201301需要在较高的湿度下才能够导致马唐发病死亡，而当接菌的环境湿度为60%时，其生防效果迅速下降。当湿度为30%时，其鲜重抑制率仅为18.6%。

表8　不同湿度对菌株ZC201301生长的影响

3讨论

生防效果好、作物安全性高和易于工业化生产是真菌除草剂是否能够开发应用的3个基本要素[15]。我们通过前期试验已经验证了菌株ZC201301对马唐、反枝苋等杂草具有良好的生防效果，同时对小麦、玉米、大豆等作物安全。

本研究发现，菌株ZC201301能够在多种培养基上生长，其可利用培养基范围较广，对培养材料的要求较为宽泛。菌株ZC201301最佳产孢培养基为马唐汁液(CAJ)培养基，其在CAJ培养基上产孢量迅速，培养7 d后其产孢量已经达到PDA培养基的167倍。通过进一步的研究，我们发现将CAJ培养基内的马唐量减少一倍，对其基本生长和产孢量没有显著影响。菌株ZC201301在25～30℃和pH 6～8条件下均能正常生长和产孢，其菌丝生长和产孢所需温度、酸碱度等范围较广，在多种环境条件下均能生长；菌株ZC201301对碳源利用差异较小，该菌株较广的环境适应能力和较宽的生长条件不仅有助于其工业化生产，而且对于其后期施用后在田间条件下存活和扩展有重要意义。进一步的筛选发现，接种前期的环境湿度是影响菌株ZC201301发挥生防效果的重要影响因子。当环境湿度小于60%时，其生防效果显著下降，而当环境湿度小于30%时，其致病力受影响较大。

CAJ培养基以杂草马唐为制作材料，杂草马唐获取方便，成本低廉，这些都是进一步工业化生产的有利条件。同时，不同于先前发现的马唐灰梨孢类生防菌[12]，菌株ZC201301产孢不需要光照等因素的诱导，而且长时间的光照会影响其孢子的产生，这也可以进一步简化后期发酵生产条件，节约成本。综合以上研究，菌株ZC201301符合杂草生防真菌要易于工业化生产的多个生物学条件，具有开发为微生物除草剂的潜力，但是使用过程中要注意环境湿度。

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The biological characteristics ofDigitariasanguinalispathogenFusariumchlamydosporumstrain ZC201301

LI Jian1, LI Yan2, GAO Xing-Xiang1, FANG Feng1, LI Mei1*

1.InstituteofPlantProtection,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Ji’nan250100,China; 2.TheAgricultureBureauofYanzhou,Jining272100,China

Abstract:Fusarium chlamydosporum strain ZC201301 showed high herbicidal activity towards Digitaria sanguinalis. In the present study, the ‘single factor at a time’ method was used to determine biological characteristics of ZC201301. It was found that the optimal mycelial growth media were potato dextrose agar (PDA) and crabgrass leaf juice (CAJ), and the optimal temperature for mycelia growth ranged from 25 to 30℃. The optimal initial pH for culture media was 6-8. Strain ZC201301 can sporulate in a variety of media, but the optimal sporulation medium was CAJ. Mycelial growth did not differ significantly in fluorescent light from that in the dark, but darkness was beneficial for sporulation. The optimal carbon sources for mycelium growth was glucose, and the best nitrogen source was NH4NO3. Oxygen is essential for mycelial growth, and mycelial growth was inhibited when the liquid/gas ratio was less than 1∶1. The herbicidal activity of strain ZC201301 was sensitive to relative humidity, and was significantly decreased when humidity was less than 60%. These results indicate the strain ZC201301 is amenable to propagation, which is important for the preparation of bio-control agents and for their survival under field conditions.

Key words:Digitaria sanguinalis; Fusarium chlamydosporum; bioherbicides; biological characteristics

*通信作者

Corresponding author. E-mail: limei9909@163.com

作者简介：李健(1986-)，男，山东临沂人，助理研究员，博士。E-mail：lijian910@163.com

基金项目：山东省自然科学基金(ZR2015CQ014)和国家863计划(2011AA10A206)资助。

收稿日期：2015-08-28；改回日期：2015-11-09

DOI：10.11686/cyxb2015374

http://cyxb.lzu.edu.cn

李健，李岩，高兴祥，房锋，李美. 马唐生防菌厚垣孢镰刀菌ZC201301的生物学特性研究. 草业学报, 2016, 25(3): 234-239.

LI Jian, LI Yan, GAO Xing-Xiang, FANG Feng, LI Mei. The biological characteristics ofDigitariasanguinalispathogenFusariumchlamydosporumstrain ZC201301. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(3): 234-239.