我国北方9份旱生-沙生植物蒙古冰草遗传多样性研究

李晓全,高有汉,刘扬,索培芬,韩冰*

(1.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010010； 2.中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010 )



我国北方9份旱生-沙生植物蒙古冰草遗传多样性研究

李晓全1,2,高有汉1,刘扬1,索培芬1,韩冰1,2*

(1.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010010； 2.中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010 )

摘要：蒙古冰草因其抗寒、抗旱特性，是欧亚大陆荒漠草原优势植物之一。本文从染色体倍性及SSR序列长度多态性两个方面对采自中国北方境内的9个蒙古冰草居群进行遗传多样性分析，发现9个蒙古冰草居群染色体基数为7，均为二倍体，在染色体倍性方面不具有多态性；共采用138对小麦SSR引物进行扩增分析，共有21对引物扩增出特异性条带，SSR引物筛选率15.2%。共扩增出特异性条带119条，平均每对引物扩增出特异性条带5.6条，SSR序列长度多态性丰富。利用POPGEN 32软件计算9个蒙古冰草居群遗传多样性指标，居群P8遗传多样性程度最低，居群P3最高。AMOVA分析显示，蒙古冰草的遗传差异主要是来自居群内个体之间。UPGMA方法聚类分析，在遗传相似系数为0.80时，9个居群被分为三大类，居群P1～P6一类，居群P7、P8为第二类，P9被单独分为一类。本研究为了解蒙古冰草遗传背景及加速其资源的合理开发利用奠定了理论基础。

关键词：蒙古冰草；染色体倍性；SSR；遗传多样性

蒙古冰草(Agropyronmongolicum)又称沙芦草，多年生疏丛禾草，是旱生-沙生荒漠草原种。生长于干旱草原的典型砂质环境，在草原化荒漠中多以伴生成分出现。主要分布于中国内蒙古、河北、山西、宁夏、陕西、甘肃等省份[1]。蒙古冰草具有较高的营养价值，其粗蛋白质含量要高于其他一些禾本科牧草，如抽穗期羊草(Leymuschinensis)的粗蛋白质含量为13.52%，老芒麦(Elymussibiricus)为13.9%，而蒙古冰草则可高达18.64%，且整个生长期内，茎叶柔软，适口性好，各类家畜均喜食[2]。而且蒙古冰草具有极高的生态价值，因其抗旱、耐寒等特性，适宜于干旱砂质地区生态型人工草地的建植。在鄂尔多斯高原沙地草场补播研究中，蒙古冰草是非常优良的牧草草种，明显改善沙地草场生态环境[3]。

冰草属是小麦属的野生近缘种属，其抗寒、抗旱、耐盐、抗病虫等优良抗性基因为小麦(Triticumaestivum)、大麦(Hordeumvulgare)等粮食作物的基因改良提供了良好的遗传基础。李立会等[4]将普通小麦与冰草(Agropyroncristatum)进行杂交，发现杂交后代表现出良好的株型结构，大穗多粒，兼抗白粉病和黄矮病，抗旱和抗寒等特点。蒙古冰草作为冰草属中典型代表植物，也可与其他牧草进行远缘杂交，从而改良原有牧草品质，培育新品种。

蒙古冰草是一种重要的资源植物，不仅具有极高的饲用价值，还具有极高的遗传价值和生态价值。国外有关冰草的研究一直以生态建设、耐牧性和营养物质的运输及储存等为主[5-6]。而对冰草遗传多样性方面的报道很少[7]。我国对蒙古冰草遗传多样性的研究较多，并取得了很大进展。解新明等[8]利用等位酶法分析了蒙古冰草6个天然居群和2个栽培品种的遗传多样性和居群结构，得出居群内的遗传多样性高于居群间的结论。兰保祥等[9]利用居群生物学方法，对35个蒙古冰草居群进行形态学性状研究，发现蒙古冰草在形态学性状上具有较丰富的遗传多样性，而且居群内遗传多样性大于居群间遗传多样性。包美莲等[10]对蒙古冰草与航道冰草正反交杂种染色体加倍植株F2代及其与亲本和杂种F1代进行ISSR分析得出亲本蒙古冰草与航道冰草间、航道冰草与正反交杂种染色体加倍植株F2间存在较大遗传距离。

蒙古冰草具有重要的生态价值、遗传价值、饲用价值，为了更深入了解它的遗传背景，加快蒙古冰草资源的合理开发利用以及为新品种的选育提供理论基础，本研究从染色体倍性及DNA序列多态性两个方面对采自中国北方的9个蒙古冰草居群进行遗传多样性分析。

1材料与方法

1.1材料

供试材料是9个蒙古冰草居群，其中P1、P2材料为本实验室野外采集，其余材料为国家牧草种质中期库提供(表1)。实验于2013年2月到2013年12月室内进行。

种子于室温暗处发芽之后移植于花盆，待幼苗长至5～8 cm时，每个居群随机选10个单株用剪刀剪下叶片，蒸馏水冲洗两遍，用滤纸吸干水后，置于-20℃保存。采用CTAB方法对叶片提取基因组DNA[11]，然后用琼脂糖凝胶电泳检测其含量和质量，-20℃保存备用。

1.2流式细胞术检测染色体倍性

利用流式细胞术对供试蒙古冰草材料进行染色体倍性分析。待测细胞必须处于单细胞悬浮液状态才可以直接进行测定，因此选用合适的分离液制备出高质量的单细胞悬液就成为流式分析的关键。配制不同的3种分离液，配方如下。

分离液①：0.2% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)[12]。

分离液②：柠檬酸 0.1 mol/L，0.2% Triton X-100[12]。

分离液③：OttoⅠ分离液：100 mmol/L 柠檬酸，0.5%(V/V)吐温-20 (pH=2～3)；OttoⅡ分离液：400 mmol/L Na2HPO4·12H2O (pH=8～9)[13]。

表1　9个居群特征详细介绍

以二倍体小麦进行分离液的筛选。室温下，取植物新鲜叶片100 mg，加入1 mL细胞核分离液，用剪刀将叶片剪碎，50 μm孔径过滤膜过滤，滤渣再加入1 mL分离液，过滤，合并滤液。2000 r/min离心3 min，弃上清，沉淀加分离液冲洗一次，离心，沉淀精确加入改良石碳酸品红染色液0.5 mL，混匀染色2 min后用红细胞计数板计数[12]。制备好的单细胞核悬液中加入200 μL 50 μg/mL碘化丙啶(PI)溶液，4℃暗处染色15 min后利用FACSCalibur流式细胞仪进行样品检测，单个样本重复3次。

DNA 含量分布图由流式细胞仪自动生成，数据用 Modfit 软件进行分析。检测中，用已确定染色体数目的二倍体小麦作对照材料调整流式细胞仪，使对照材料的主峰位于 50 道附近，由此仪器检测图示当中，50,100和 150道附近的峰显示的细胞核相对DNA含量分别为50道的1,2和3倍。染色体倍性则为二倍体，四倍体，六倍体，其余为非整倍体。以下公式来计算核DNA含量或染色体倍性水平,待测样DNA含量或倍性水平=对照样核DNA含量或倍性水平×(待测样本G0或G1荧光均值/参照样本G0或G1峰荧光均值)。

1.3SSR分析

SSR引物参考Roder等[14]构建的小麦SSR分子标记连锁图，引物选取遵循均匀分布在每条染色体长臂、着丝粒附近、短臂的原则，使被选中的引物可以为蒙古冰草构建简易标记连锁图。在http：//wheat.pv.usda.gov上找到相应的引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成共138对引物。PCR扩增体系为dNTP 1.4 μL、MgCl22.0 μL、rTaq酶 0.3 μL、正反向引物各0.5 μL和模板DNA 1.5 μL，总体系25 μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，50～60℃(根据引物的退火温度设定)复性50 s，72℃延伸90 s，共35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。将PCR产物进行8%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,最后进行银染观察其条带情况[15]。

在聚丙烯酰胺凝胶上以“0”和“1”统计SSR扩增条带，在相同的迁移率位置上，有扩增条带记为“1”，无扩增条带记为“0”，构建原始“0，1”二元数列矩阵。用POPGEN 32软件计算观测等位基因变异数(observed number of alleles，NA)、有效等位变异数(effective number of alleles，NE)、多态位点百分比(percentage of polymorphic locus，PPL)、遗传距离和遗传一致性(Nei’s unbiased genetic distance and genetic identity)、香农指数(Shannon’s information index, SI)。用AMOVA软件分析居群间、居群内遗传变异。根据遗传一致性，采用UPGMA法，利用NTSYS-pc v.2.02软件作出聚类分析。并将聚类分析与地理距离用SPSS软件进行相关性分析。

2结果与分析

2.1流式细胞术检测染色体倍性

以小麦为参照物对3种分离液进行筛选，发现分离液③中单细胞核数明显多于其他分离液，所以选取分离液③用于后续实验(表2)。

从图1的CK中看到，对照二倍体小麦的峰值在50道附近，即50道的G1期峰值为二倍体。调整阀值，使其G1期位于50道附近，以此检测9个居群蒙古冰草的细胞核悬液。流式细胞仪测定结果显示，所有居群的蒙古冰草G1期峰值处于50道附近，与对照小麦的倍性相同，均为二倍体，染色体基数为7(图1,表3)。

表2　不同分离液从小麦中分离的细胞核数

2.2DNA提取结果

利用CTAB法提取了9个蒙古冰草居群的90个单株的基因组DNA，稀释10倍之后各取1 μL基因组DNA和1 μL 6×Loading buffer混好后，用0.7%琼脂糖凝胶检测。从图2中可以看出，基因组DNA条带清晰、整齐、亮度也好，说明DNA 含量高，DNA较完整，没有蛋白质污染，符合后续实验要求。

图1　蒙古冰草染色体倍性荧光分析图Fig.1　Fluorescence analysis of A. mongolicum ploidy

居群Populations染色体倍性ChromosomeploidyS期细胞百分率ThepercentageofSperiodcells(%)G1期细胞百分率ThepercentageofG1periodcells(%)变异系数Coefficientofvariation(CV,%)居群Populations染色体倍性ChromosomeploidyS期细胞百分率ThepercentageofSperiodcells(%)G1期细胞百分率ThepercentageofG1periodcells(%)变异系数Coefficientofvariation(CV,%)CK257.3042.7010.84P5266.0633.6312.24P1258.6941.3110.99P6245.6854.3215.20P2256.4943.5111.91P7250.1549.8513.25P3257.7942.2113.39P8245.4954.5112.47P4258.0341.9712.56P9260.5839.4211.40

2.3多态性引物的筛选

图2　蒙古冰草居群P1的10个单株基因组DNA电泳检测图Fig.2　The electrophoresis pattern of genome DNA of A. mongolicum from population P1

多态性扩增条带数和其百分率是反映实验材料多样性程度的重要指标，同时也间接反映了引物的多态信息量。本研究采用的138对小麦SSR引物中有21对引物扩增到明显差异性条带，共119条，引物筛选率15.2%。所有引物中，引物wmc744扩增条带数最多，为9条带；引物wmc310、wmc491、wmc640(图3)扩增条带数最少，为3条。有效等位基因数(NE)和多态性信息指数(polymorphism information coefficient，PIC)等参数是体现群体变异的重要指标。PIC同时也反映了引物的多态性和区分居群的能力，其值依公式计算PIC=1-∑Pi2，其中Pi为第i个基因的基因频率。SSR引物多态性信息指数(PIC)在0.321 (wmc640)～0.920 (cfd15) 之间，平均PIC为0.694(表5)。当PIC大于0.5时多态性高，在本研究中，PIC大于0.5的引物共17对，占81%；当PIC在0.25与0.5之间则多态性为中度，共有4对，分别为wmc109、wmc310、wmc468和wmc640，占19%；没有引物的PIC低于0.25(低多态性)。说明这21对小麦SSR引物在蒙古冰草上具有较高的多态性，这21对引物可有效对9个居群进行区分。

图3　引物wmc640对9个蒙古冰草居群单株基因组DNA的SSR扩增图谱Fig.3　SSR amplification pattern of A. mongolicum genomic DNA from 9 populations by primer wmc640

2.4蒙古冰草居群遗传多样性

在9个居群中，多态基因位点数最多的是居群P3，为52个；多态基因位点数最少的是居群P8，为33个(表4)。这表明居群P8是9个居群中多样性程度最低的一个居群，而居群P3则是多样性程度最高的居群。等位基因数、有效等位基因数是描述遗传多样性的重要指标。等位基因数、有效等位基因数分别是居群P3、P4最高，表明这两个居群内多样性程度较高；居群P5、P7最低，则代表了这两个居群内遗传多样性较低。

2.5蒙古冰草居群遗传分化

居群的遗传分化用Wright(1978)的F统计量来度量，其中Fis(the group of inbreeding coefficient，居群内近交系数)和Fit(the total number of inbred line， 总近交系数)分别表示整个物种的基因频率和居群的平均基因频率偏离Hardy-weinberg遗传平衡的程度，Fst(the genetic differentiation，遗传分化)表示居群间的遗传变异占总遗传变异的比率，用来衡量群体分化的程度。9个居群的居群内近交系数Fis和总近交系数Fit变化范围分别是：-1.000(引物wmc167)到0.421(引物wmc491)之间、-0.249(引物wmc109)到0.690(引物barc158)之间，平均值分别是-0.164和0.242。遗传分化系数Fst的变化范围0.095(引物wmc109)到0.832(引物wmc167)之间，平均0.333。居群内近交系数Fis值为-0.164<0，表明供试材料居群内的随机交配杂合度过量；总近交系数Fit值为0.242≠0，表明蒙古冰草总体存在一定的近亲交配。基因流Nm(gene flow，基因流)与居群间的基因分化有关，即物种基因流越大，居群间遗传分化越小，基因流Nm大,阻止居群间的遗传分化。当Nm<1时，居群间大部分遗传分化由遗传漂变引起；当Nm>1时，则防止了因遗传漂变而引起的居群间遗传分化。本研究Nm在0.051(引物wmc167)到3.878(引物gwm664)之间，平均1.270(表5)，表明供试材料居群间存在较大基因流，说明基因的遗传漂变将不会导致种群遗传分化。

表4　9个蒙古冰草居群扩增情况

表5　引物扩增情况

Nm=1/4(1/Fst-1).

AMOVA分析结果表明，居群间变异为16.36%，居群内个体的变异百分比为83.64%(表6)。说明了蒙古冰草的差异主要是来自居群内个体之间。

表6　9个蒙古冰草居群遗传结构的分子方差分析

图4　9个蒙古冰草居群的UPGMA聚类图 Fig.4　The UPGMA dendrogram for 9 A. mongolicum populations

2.6蒙古冰草居群聚类分析

利用POPGEN 32软件计算各居群间遗传距离和遗传一致度，如表7。在居群间的遗传一致度系数中，居群P2和居群P8之间遗传一致度系数最小，为0.735，表明这两个居群间遗传距离最远；居群P5和居群P6之间遗传一致度系数最大，为0.959，表明这两个居群间遗传距离最近。依据Nei’s(1978)遗传一致度数据，利用NTSYS软件对9个蒙古冰草居群，采用UPGMA的方法进行聚类分析(图4)，在遗传相似系数为0.80时，9个居群被分为三大类，前6个居群被集中于第一类，居群P7、P8被分为第二类，居群P9被单独分为一类。将聚类结果与地理距离利用SPSS软件进行相关性分析，Pearson 相关性指数0.138<0.2，为无相关性。

3讨论

蒙古冰草以其青绿期长，适口性好，被很多牲畜所喜食等诸多优点成为中国北方草原的优良草种，研究它的遗传差异性为培育新品种提供理论基础；并且其作为小麦等粮食作物的野生近缘种，又含有与抗旱、抗寒、耐贫瘠等相关的优良抗性基因，研究它的遗传多样性可为小麦等粮食作物的改良提供遗传基础。

细胞在分裂过程中因发生染色体异常性分离而导致的后代细胞中核内染色体数目不是染色体基数的整倍数的现象称非整倍体发生。非整倍体是染色体变异材料，它的发现与应用是遗传研究和染色体工程育种的一项重要内容。在植物及低等动物中，非整倍体对发育影响较小，很多非整倍体是可以存活的[16]，它的出现为遗传多样性研究提供了宝贵材料。

本研究从染色体倍性与DNA序列多态性两个方面检测蒙古冰草遗传多样性。利用流式细胞仪技术检测发现所选蒙古冰草材料均属二倍体植株，染色体基数为7，并不存在染色体非整倍性问题，供试材料在染色体倍性方面亦无遗传多样性，验证了二倍体植物非整倍体的自然发生率较低的结论[17]。蒙古冰草与小麦染色体基数相同，因此试图利用小麦SSR引物对蒙古冰草构建简易染色体标记连锁图。用138对小麦SSR引物对采自不同地区的9个居群进行分析，共筛选出有明显特异性扩增条带的引物21对，筛选率15.22%。SSR引物具有通用性，通过梯度PCR技术利用小麦的SSR引物Xgwm32-3A对冰草进行了成功扩增[18]。于卓等[19]利用200对高粱(Sorghumbicolor)SSR引物对高丹草(sorghum hybrid sudangrass)新品系进行研究，发现有12对(6%)可扩增出有多态性、清晰的条带。因蒙古冰草与小麦的近缘关系，因此测得的引物筛选率还是较高的。

遗传分化是反映遗传结构的重要指标。蒙古冰草居群间变异百分比为16.36%，居群内个体的变异百分比为83.64%，且差异均达显著水平。表明蒙古冰草的遗传多样性主要来自居群内。这与蒙古冰草的异花授粉和风媒传粉密切相关。这种结果与解新明等[8]研究结果相一致。这说明在蒙古冰草种质资源保护中，不仅要保护每个居群，同时更应该注重居群内个体间异质性的保护。基因流一定程度上能反映居群间遗传物质的交流。大于1的基因流会抵制遗传漂变的作用，防止由此导致的居群遗传分化的发生。本研究中测得的居群间基因流Nm值为1.27，表明影响蒙古冰草遗传结构的主导因素是由于居群内各个体间的差异。

对9个居群进行聚类分析发现，遗传距离与地理距离并无相关性。居群P3与P8采自中国内蒙古巴彦淖尔市不同的旗县，其遗传相似系数为0.759，和居群P5与P6间遗传相似系数0.959相比较小。表明供试9个蒙古冰草居群各自的地理分布并不是影响其群体遗传结果的决定性因素。

4结论

采自中国北方境内的9个居群的蒙古冰草染色体基数为7，均为二倍体，9个蒙古冰草居群在染色体倍性方面不存在多态性，不存在非整倍体现象；21对SSR引物共扩增出特异性条带119条，平均每对引物扩增出特异性条带5.6条。在遗传相似系数为0.80时，9个居群被分为三大类。本研究揭示了蒙古冰草的遗传多样性及遗传结构影响因素，为物种种质资源保护和利用提供了重要依据。

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The genetic diversity of 9 populations of dry-desertAgropyronmongolicumcollected in northern China

LI Xiao-Quan1,2, GAO You-Han1, LIU Yang1, SUO Pei-Fen1, Han Bing1,2*

1.CollegeofLifeSciencesInnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010010,China; 2.GrasslandResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences,Hohhot010010,China

Abstract:Agropyron mongolicum is one of the dominant species in desert steppe across Eurasia, due primarily to its cold and drought resistance. In this study, we analyzed chromosome polymorphism and DNA polymorphism in 9 populations of A. mongolicum in northern China. The chromosome number of the 9 populations was 7. Cells were diploid and showed no polymorphism in chromosome ploidy. A total of 138 pairs of wheat SSR primers were amplified and analyzed. A total of 21 primer pairs were amplified with specific fragments. The screening rate of SSR primers was 15.2%. A total of 119 specific bands were amplified: specificity was 5.6 and the polymorphism of DNA was rich. POPGEN 32 software was used to calculate the genetic diversity of the 9 populations of A. mongolicum. Population P8 was found to have the least level of diversity, while P3 had the highest. AMOVA software was used to analyze genetic differentiation, indicating that genetic differences come mainly from individuals in the populations. The UPGMA method was used for a cluster analysis of the 9 populations. When the genetic similarity coefficient is 0.80, the materials tested divided into three groups: P1-P6, P7-P8 and P9. This paper lays the foundation for the development and utilization of new varieties of A. mongolicum.

Key words:Agropyron mongolicum; chromosome ploidy; SSR; genetic diversity

*通信作者

Corresponding author. E-mail：hb_nmg@163.com

作者简介：李晓全(1991-)，男，河北衡水人，在读硕士。E-mail：1206966950@qq.com

基金项目：国家自然科学基金(31060057)，中国科学院西部之光“人才培养”项目匹配经费和中国农业科学院草原研究所农业科技创新工程资助。

收稿日期：2015-04-24；改回日期：2015-07-17

DOI：10.11686/cyxb2015219

http://cyxb.lzu.edu.cn

李晓全，高有汉，刘扬，索培芬，韩冰. 我国北方9份旱生-沙生植物蒙古冰草遗传多样性研究. 草业学报, 2016, 25(3): 77-85.

LI Xiao-Quan, GAO You-Han, LIU Yang, SUO Pei-Fen, Han Bing. The genetic diversity of 9 populations of dry-desertAgropyronmongolicumcollected in northern China. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(3): 77-85.