米渣蛋白双酶法制备工艺的研究

曾国强，胡中泽、2

(1.武汉轻工大学 食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023;2.农产品加工湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430023)



米渣蛋白双酶法制备工艺的研究

曾国强1，胡中泽1、2

(1.武汉轻工大学 食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023;2.农产品加工湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430023)

摘要：以淀粉糖生产过程中产生的副产物米渣为原料，先用正己烷进行脱脂，采用高温α-淀粉酶和纤维素酶双酶法对米渣进行酶解，提高蛋白质的纯度，研究了液固比、高温α-淀粉酶添加量、纤维素酶添加量、双酶酶解时间对蛋白质纯度的影响。在单因素试验的基础上，通过正交试验优化，确定了米渣蛋白的最佳提取工艺为：液固比8∶1，高温α-淀粉酶添加量300 U/mL，纤维素酶添加量110 U/g，高温α-淀粉酶作用时间1.5 h，纤维素酶作用时间2.5 h。在此条件下米渣蛋白的纯度为93.8%，得率为88.76%。

关键词：米渣蛋白；蛋白质纯度；酶添加量

1引言

米渣是以早籼稻或碎米为原料生产淀粉糖或发酵生产谷氨酸、柠檬酸、乳酸以及生化药品时，米粉高温液化或是糖化后的副产品。在以大米为原料的工业生产 (如发酵和淀粉糖等) 中一般只利用大米的淀粉部分， 副产品米渣中蛋白质含量为 40%以上，是纯大米的5—7倍[1]。米渣中的蛋白质虽然经过高温处理，但它仍保留了大米中蛋白质的部分性质，具有大米蛋白的很多优点，不含影响食物利用的毒性物质和酶阻碍物[2]。大米蛋白氨基酸组成平衡合理，与WHO/FAO推荐理想模式非常接近[3]。大米蛋白具有良好的氨基酸组成配比和低过敏性，消化率较高，是一种优良的植物蛋白[4]。在谷物蛋白中，大米蛋白的生物价(B.V.)和蛋白价(P.V.)均比其他蛋白质高[5]。长期以来，米渣以干粉的形式廉价卖给饲料厂，经济效益很低，米渣的增值利用一直是企业难以解决的难题[6]。

米渣中提取大米蛋白的方法主要有碱洗酸沉法、纤维素酶和酸洗法，碱酶两步法等[7]。强碱能使大米淀粉的紧密结构变得疏松，同时，碱液对蛋白质分子的次级键特别是氢键有破坏作用，从而促使淀粉和蛋白质分离，但是强碱的处理会引起大米蛋白理化性质的改变，降低其营养价值，产生有毒物质。另外，碱法还具有等电点要大量消耗酸、脱盐纯化难度大等问题[8]。酶法提取主要是采用一些蛋白酶对大米蛋白进行降解和修饰作用，使其变成可溶性多肽而被提取，酶法提取的米渣蛋白溶解性较好，但酶法提取率较低[9]。米渣中除蛋白质外，非蛋白成分主要有油脂、未经酶水解或水解不完全而残留的纤维素、淀粉和糊精等糖类物质。除杂法实质上是一个纯化的过程，从理论上分析具有更多的合理性。由于纤维素酶和淀粉酶的使用使提取成本有所提高，因此提取的工艺需要进一步优化，降低生产成本，提高产品的纯度和提取率[10]。本文采用排杂法制备米渣蛋白，先用正己烷脱脂，用高温α-淀粉酶酶解去除大部分淀粉，在用纤维素酶酶解去除大部分纤维素等多糖，用高温度水水洗米渣蛋白去除糊精、酶解产生的糖类物质和盐类物质，最后获得高纯度的米渣蛋白。

2材料与方法

2.1主要材料与试剂

米渣：(湖北仙源米业集团有限公司)，高温α-淀粉酶：20 000 U/mL,( 江苏锐阳生物科技有限公司)，纤维素酶：10 000 U/g,(阿拉丁(上海)试剂有限公司)，正己烷、氢氧化钠、浓硫酸、浓盐酸、定氮指示剂、硫酸铜、硫酸钾：均为分析纯。

2.2主要设备和仪器

pH计FE20:(梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司)；85-2数显恒温磁力搅拌器：(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；SHA-C2水浴恒温振荡器：(常州华冠仪器制造有限公司)；k9840自动凯式定氮仪：(济南海能仪器股份有限公司)；电热鼓风干燥箱：(上海一恒科学仪器有限公司)；SHZ-III型循环水真空泵：(上海亚荣生化仪器厂)。

2.3试验方法

2.3.1米渣蛋白提取工艺流程

米渣→过20目筛→脱脂→抽滤→通风厨吹干→加入一定比例的水→用氢氧化钠溶液调节pH至6.0→90 ℃水浴10 min，摇速120 r/min→加入高温α-淀粉酶反应一段时间→冷却→调节pH值至4.5→55 ℃水浴10 min，摇速120 r/min→加入纤维素酶反应一段时间→抽滤→90 ℃水洗→抽滤→电热鼓风干燥箱内干燥并保存样品

2.3.2蛋白质含量测定方法

蛋白质：按GB5009.5-2010中的凯式定氮法进行测定，其中蛋白质系数为6.25。

2.3.3米渣脱脂

参照文献[1]的方法加以改进，称取20 g过20目筛的米渣，加入正己烷，料液比为1∶3，在60 ℃水浴恒温振荡器下脱脂4 h，摇速为120 r/min。

2.3.4单因素试验

单因素试验在液固比8∶1、高温α-淀粉酶添加量200 U/mL、纤维素酶添加量100 U/g、酶解时间：高温α-淀粉酶1 h与纤维素酶2 h的基础上，相应变换某因素的水平。液固比选择4∶1、6∶1、8∶1、10∶1，高温α-淀粉酶添加量选择100 U/mL、200 U/mL、300 U/mL、400 U/mL，纤维素酶添加量选择60 U/g、80 U/g、100 U/g、120 U/g，酶解时间选择高温α-淀粉酶1 h与纤维素酶1 h、高温α-淀粉酶1 h与纤维素酶2 h、高温α-淀粉酶2 h与纤维素酶3 h、高温α-淀粉酶2 h与纤维素酶4 h，按提取工艺流程提取，测样品的蛋白质纯度，考察各因素对蛋白质纯度的影响。

2.3.5正交试验

选取液固比、高温α-淀粉酶添加量、纤维素酶添加量、酶解时间4个因素，以样品的蛋白质纯度为指标，用 L9(34)正交实验表进行正交实验，因素水平表如表1所示。

3结果与分析

3.1单因素实验结果与分析

3.1.1液固比对米渣蛋白质纯度的影响

液固比影响酶与底物接触和碰撞的几率，与酶解工艺相关，因此会影响蛋白质纯度，液固比对蛋白质纯度的影响如图1所示。

表1正交试验因素水平表

水平因素(A)液固比(B)高温α-淀粉酶添加量/(U/mL-1)(C)纤维素酶添加量/(U/g-1)(D)酶解时间1725090高温α-淀粉酶0.5h,纤维素酶1.5p8300100高温α-淀粉酶1h,纤维素酶2p9350110高温α-淀粉酶1.5h,纤维素酶2.5h

图1　液固比对蛋白质纯度的影响

从图1可看出，液固比增大，蛋白质纯度呈上升趋势，液固比从4到6时，蛋白质纯度不高，而且上升趋势趋于平稳。液固比从6到8，蛋白质纯度有明显的上升趋势，可能是液固比从6开始，酶与底物碰撞几率越来越大，因此蛋白质纯度越来越高，液固比从8开始，酶与底物接触的几率很大且趋于稳定，从后期液体处理量以及经济角度考虑，选择液固比8。

3.1.2高温α-淀粉酶添加量对蛋白质纯度的影响

高温α-淀粉酶添加量直接影响酶解工艺，影响去淀粉的程度和能力，从而影响蛋白质的纯度，高温α-淀粉酶添加量对蛋白质纯度的影响如图2所示。

图2　高温α-淀粉酶添加量对蛋白质纯度的影响

从图2看出高温α-淀粉酶添加量从100 U/mL到300 U/mL时，蛋白质纯度呈上升趋势，从300 U/mL开始，蛋白质纯度呈下降趋势，可能是300 U/mL之前，高温α-淀粉酶添加量越大，酶与底物接触和碰撞的几率就越大，酶解越彻底，蛋白质纯度就越高，300 U/mL之后，高温α-淀粉酶添加量越大，反而抑制了酶与底物接触和碰撞，酶解不彻底，蛋白质纯度更低。因此选择高温α-淀粉酶添加量为300 U/mL。

3.1.3纤维素酶添加量对蛋白质纯度的影响

纤维素酶添加量影响去纤维素等多糖的程度和能力，从而影响蛋白质纯度，纤维素酶添加量对蛋白质纯度的影响如图3所示。

从图3可看出，随着纤维素酶添加量变化，蛋白质纯度呈波浪形变化，纤维素酶添加量从60 U/g到80 U/g，蛋白质纯度呈下降趋势。纤维素酶添加量从80 U/g到100 U/g，细胞壁破裂的较多，纤维素酶添加量越大，加速了纤维素等物质的酶解，蛋白质纯度呈上升趋势。纤维素酶添加量从100 U/g到120 U/g，随着纤维素酶添加量增加，反而抑制了酶与底物接触与碰撞。因此选择纤维素酶添加量为100 U/g。

3.1.4酶解时间对蛋白质纯度的影响

高温α-淀粉酶和纤维素酶的酶解时间影响去除淀粉和纤维素等物质的程度，从而影响蛋白质纯度，酶解时间对蛋白质纯度的影响如图4所示。

图4　酶解时间对蛋白质纯度的影响注:1表示高温α-淀粉酶1 h,纤维素酶1 h,2表示高温α-淀粉酶1 h,纤维素酶2 h,3表示高温α-淀粉酶2 h,纤维素酶3 h,4表示高温α-淀粉酶2 h,纤维素酶4 h

从图4可看出，从高温α-淀粉酶1 h、纤维素酶1 h到高温α-淀粉酶1 h、纤维素酶2 h，随着纤维素酶时间从1 h到2 h，可能是此时底物浓度较大，随着纤维素酶酶解时间增长，蛋白质纯度增加。从高温α-淀粉酶1 h、纤维素酶2 h到高温α-淀粉酶2 h、纤维素酶3 h，蛋白质纯度趋于平稳趋势。从高温α-淀粉酶2 h、纤维素酶3 h到高温α-淀粉酶2 h、纤维素酶4 h，蛋白质呈下降趋势，可能是因为随着纤维素酶的作用时间增长，酶活力下降。因此选择高温α-淀粉酶1 h,纤维素酶2 h。

3.2正交试验结果及分析

正交试验结果及分析如表2和表3所示。

表2正交试验结果

试验号ABCD蛋白质纯度/%1111189.42122291.73133392.34212392.15223193.36231292.773132908321392.59332189.2K1276.1277.5270.9184.4K2276274.2185.6274.8K3181.7182.1277.3274.6k191.190.591.590.6k292.792.59191.5k390.691.491.992.3极差R2.120.91.7

表3主体间效应的检验

SourceTypeIIISumofSquaresdfMeanSquareFSig.CorrectedModel37.320a84.66567.7180.000Intercept150590115059021859940.000A14.65327.327106.3550.000B12.04026.02087.3870.000C2.29321.14716.6450.001D8.33324.16760.4840.000Error0.62090.069Total15062818CorrectedTotal37.94017

注：a表示R Squared 0.984(Adjusted 及squared=0.969)

根据表2的试验结果可知：蛋白质纯度影响因素由大到小依次是液固比A>高温α-淀粉酶添加量B>酶解时间D>纤维素酶C，由各因素的平均值可以比较出最优水平，并初步确定最佳组合为A2B2C3D3,，即液固比8∶1，高温α-淀粉酶添加量300 U/mL，纤维素酶添加量110 U/g，高温α-淀粉酶酶解时间1.5 h，纤维素酶酶解时间2.5 h。

根据表3的试验结果可知：液固比A、高温α-淀粉酶添加量B、纤维素酶C、酶解时间D对蛋白质纯度都有非常显著的影响，影响因素的主次顺序为液固比A>高温α-淀粉酶添加量B>酶解时间D>纤维素酶C，与极差法分析结果一致。对最优组合条件进行验证的结果：蛋白质纯度为93.8%，得率为88.76%。

3结论

采用双酶法制备米渣蛋白，蛋白质纯度和得率均较高，通过实验确定了米渣蛋白双酶法制备的最佳工艺为：液固比8∶1，高温α-淀粉酶添加量300 U/mL，纤维素酶添加量110 U/g，高温α-淀粉酶作用时间1.5 h，纤维素酶作用时间2.5 h。在此条件下米渣蛋白的纯度为93.8%，得率为88.76%。

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Study on double enzymatic preparation of rice residue protein

ZENGGuo-qiang1，HUZhong-ze1、2

(1.School of Food Science and Engineeing，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China;2.Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products，Wuhan 430023，China)

Abstract：By product rice residue of starch sugar production process for raw materials, rice residue was first degreased with n-hexane, rice residue was hydrolysised at high temperature α- amylase and cellulase double enzyme, to improve the purity of protein.Effects of liquid-solid ratio, the amount of high-temperature α- amylase, cellulase dosage, double enzyme hydrolysis time on protein purity were studied. On the basis of single factor test, through orthogonal experiment, best rice residue protein good extraction process was determined: liquid to solid ratio of 8∶1, the amount of high-temperature α-amylase 300U/mL, cellulase enzyme dosage 110U/g, high temperature α- amylase time 1.5h, the cellulase reaction time 2.5h. Under these conditions, rice residue protein purity was 93.8%, yield was 88.76%.

Key words：rice residue protein;purity of protein;the amount of enzyme

中图分类号：TS 210.9

文献标识码：A

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2016.01.022

文章编号：2095-7386(2016)01-0099-05

作者简介：曾国强(1991-)，男，硕士研究生，E-mail：974401442@qq.com.

收稿日期：2015-11-30.