苏云金芽胞杆菌的鉴定及对椰子织蛾的致死作用

孙晓东， 阎　伟， 李朝绪， 刘　丽， 覃伟权*

1中国热带农业科学院椰子研究所，海南 文昌 571339；

2东北农业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030



苏云金芽胞杆菌的鉴定及对椰子织蛾的致死作用

孙晓东1，2， 阎伟1， 李朝绪1， 刘丽1， 覃伟权1*

1中国热带农业科学院椰子研究所，海南 文昌 571339；

2东北农业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030

摘要:【背景】利用采集到的样品分离出苏云金芽胞杆菌菌株，针对椰子织蛾幼虫进行室内生物活性测定，以期获得对椰子织蛾幼虫具有高毒力菌株，并为椰子织蛾的生物防控提供理论和技术依据，同时为转Bt基因作物提供新的基因资源。【方法】在海南岛椰子织蛾潜在分布区采集样品，利用温度法筛选苏云金芽胞杆菌并进行形态学和分子生物学鉴定，采用浸叶法进行Bt菌株对椰子织蛾幼虫的生物活性测定。【结果】海南省保亭县土壤样品中筛选出8株菌株，电子显微镜下观察到该批菌株含有菱形、球形、方形晶体；通过分子生物学鉴定明确了6株菌株含有cry基因，2株没有鉴定出cry基因；利用相同浓度菌悬液对椰子织蛾幼虫进行了生物活性测定，结果表明，50 μg·mL(-1)的BAT10菌株杀虫晶体蛋白对椰子织蛾幼虫的致死率达100%，同样浓度的29-15-4与BAT20菌株杀虫晶体蛋白对椰子织蛾幼虫的致死率超过80%，其余5株Bt的杀虫晶体蛋白致死率较低，致死率小于50%。【结论与意义】本试验筛选出1株高毒力菌株和2株效果较好的Bt菌株，可应用于椰子织蛾的生物防控。

关键词:Bt； 椰子织蛾； 鉴定； 生物活性

椰子织蛾OpisinaarenosellaWalker属鳞翅目Lepidoptera织蛾科Qecophoridae,英文名coconut black-headed caterpillar，又称椰子木蛾、黑头履带虫、椰柱蛾、食叶履带虫等，主要分布于斯里兰卡、印度孟加拉、缅甸、印度尼西亚、巴基斯坦、泰国、马来西亚等地(武怀恒等，2014; Venkatesanetal.，2009)。椰子织蛾幼虫取食叶片，严重时入侵啃食整个树冠，导致植株发育缓慢，果实产量大幅减少。对椰子织蛾进行有害生物风险分析，结果显示，其属于高风险有害生物，在我国多地易定殖(阎伟等，2013)，对我国的椰子、槟榔、蒲葵、中东海枣、大王棕等棕榈作物(刘向蕊等，2014a)威胁很大，在我国具有严重的生态与经济危害性。

苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是一种目前世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂，由于其高效、低毒、安全、经济，是最具发展潜力的微生物杀虫剂。目前已发现的大多数Bt菌株均能产生多种类型的晶体蛋白，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物等具有特异性的杀虫活性(蔡吉林等，2013)。Bt作为生防菌中最重要的一种，在使用上有着靶标性强、对人类和牲畜不会造成毒害以及环境友好型的特点，但是由于转Bt基因作物在全球的推广与种植，使很多靶标害虫产生了不同程度的抗性(崔树松等，2013； Gassmannetal.,2014)。

目前，针对椰子织蛾的生态学(刘向蕊等，2014b)、生物学鉴定(李后魂等，2014)、化学防控(Shivashankaretal.，2000)、天敌寄生蜂防控(Venkatesanetal.，2003)等相关方面已有研究，尚未见到利用Bt防控椰子织蛾的相关研究与报道。本文利用在椰子织蛾入侵风险区采集的样品并分离出的Bt菌株针对椰子织蛾幼虫进行室内生物活性测定，以期获得对椰子织蛾幼虫具有高毒力的菌株，为椰子织蛾的生物防控提供理论和技术依据，同时为转Bt基因作物提供新的基因资源。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1培养基LB固体与液体培养基、1/2 LB固体与液体培养基，培养基配制方法参见Sambrooketal.(1989)。

1.1.2菌株8株Bt菌株分离自海南省保亭县土壤样品，菌株HD73为中国农业科学院植物保护研究所赠送。

1.1.3引物序列参见表1。

表1　鉴定引物及序列

1.1.4主要试剂Taq酶、限制性内切酶、PMD19-T载体、JM109感受态细胞、凝胶回收试剂盒均购自Takara公司；Byeotime公司的BAC蛋白浓度定量试剂盒(增强型)。

1.2方法

1.2.1Bt扫描电镜样品的制备分离纯化的Bt菌株在1/2 LB固体培养基平板上划线，置30 ℃下培养48 h，在无菌工作台上刮取少许菌苔，纯水清洗后再加入适当纯水充分悬浮，将砸碎的细小碎片浸润在悬浮液中2 min后取出，低温冷冻干燥后备用。

1.2.2Bt质粒的提取与鉴定分离纯化后的Bt菌株在液体LB中(230 r·min-1、30 ℃) 培养12 h ，采用Narvaetal.(1991)的方法提取质粒。采用PCR-RFLP方法鉴定杀虫晶体蛋白基因，提取Bt菌株的质粒DNA进行cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10类基因的PCR-RFLP鉴定，鉴定引物参见表1，鉴定方法参见宋福平等(1998)及苏旭东(2005)。

1.2.3Bt菌悬液所含蛋白的定量先接种1/2 LB固体培养基至菌体裂解(30 ℃恒温，48 h)；无菌操作刮取菌体，然后使用灭菌去离子水制备成菌悬浮液，使用Byeotime BAC蛋白浓度定量试剂盒(增强型)进行菌悬浮液的蛋白浓度定量。

1.2.4cry基因的克隆使用凝胶回收试剂盒将PCR产物进行回收并纯化，纯化后的产物按照目的片段与pMD19-T载体1∶3的比例16 ℃连接3 h，取10 μL连接产物加入到100 μL JM109感受态细胞中进行热激转化，具体转化方法参见束长龙等(2007)。转化完成后挑取阳性克隆在上海生工公司进行核酸测序。

1.2.5杀虫活性测定采用浸叶法(刘楠等，2010)。椰子织蛾幼虫为本实验室饲养，BAT-10的蛋白溶液设置为40 μg·mL-1。将椰子叶片用清水洗净晾干，选取鲜嫩一致的叶片切成15 cm的段状，在各个浓度的混合均匀的蛋白溶液(含0.1%吐温-80)中浸泡5 min，晾干，放入生测瓶中，每瓶接4龄幼虫30头，每个处理重复3次，28 ℃生化培养箱中保温，培养72 h后调查死、活虫数，并观察幼虫取食情况。

2结果与分析

2.1菌株的分离与形态鉴定

菌株在1/2 LB培养基上培养48 h后形成单菌落，菌落乳白色，圆形或近圆形，边缘整齐，菌落中间较厚，向四周逐渐变薄。扫描电镜下观察到菌株菌体为长杆状，芽孢为长圆棒状，晶体有菱形、球形、方形等形状(图1)，其中菌株BAT10、BAT20、1-11、BAT7、BAT17、8-12的伴孢晶体为菱形，29-15-4晶体为球形，BAT35晶体为菱形和方形，初步鉴定为苏云金芽胞杆菌。

图1　Bt菌株的扫描电镜图片

2.2分子水平的鉴定

分别提取Bt菌株的质粒DNA并以表1中cry基因鉴定引物进行cry基因的鉴定，PCR扩增产物经凝胶回收试剂盒(Takara)纯化后连接T载体(Takara)进行克隆，挑取阳性单克隆送样上海生工进行测序，具体结果见表2，其中6株含有cry基因，2株没有鉴定出已知基因型。结果表明，BAT10、BAT20、1-11、BAT7、BAT17同时含有cry1、cry1I、cry2类的基因；菌株29-15-4只含有cry8类的基因；BAT35和8-12未鉴定出已知基因型。菌株基因型的多样性与土壤状况、样品海拔无明显规律性。

2.3Bt菌株对椰子织蛾的毒力

生物测定结果显示，8株菌株对椰子织蛾4龄幼虫具有一定的杀虫活性，具体结果见表3。其中,菌株BAT10对椰子织蛾幼虫的校正致死率达100%，与对照及其他菌株有显著差异，杀虫效果最显著；菌株BAT20与菌株29-15-4校正致死率为80%～90%，2株菌株间差异不显著，杀虫效果较显著；8-12、BAT7、BAT35、BAT17、1-11校正致死率低于50%，杀虫效果不显著。

表2　Bt菌株cry基因型鉴定

(+)阳性对照：苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种标准菌株HD73。

(+) Positive control:B.thuringiensissubsp.kurstakiHD73.

表3　Bt菌株对椰子织蛾的杀虫活性(72 h )

不同英文字母表示差异显著(P<0.05)。

Letters denote significant differences among strains (P<0.05).

3讨论

本文采用PCR-RFLP法对8株菌株进行了cry基因鉴定，但是有2株未鉴定出cry基因，不过在光学显微镜下可以确定其产生晶体，推测原因可能是菌株含有的cry基因的序列比较新，现有的鉴定引物尚不能发现其基因型，因此需要通过更多的克隆方法来明确其菌株内的基因型。

迄今为止，我国对苏云金芽胞杆菌的研究主要针对农业害虫，如倪万潮等(1998)在20世纪90年代研发并推广的转Bt基因抗虫棉，可用来防控农业害虫棉铃虫，朱勋等(2011)发现了对小菜蛾高毒力的Bt菌株。另外，Bt在大田应用方面也取得了良好的生态效益和经济效益，而在林业害虫的防治和研究方面相对缓慢，将Bt菌株应用到防治林业害虫椰子织蛾的研究还未见相关报道，离市场化还有很大的差距。

本试验通过Bt菌株对椰子织蛾幼虫的生物活性测定筛选出1株高毒力菌株和2株效果较好的Bt菌株，下一步将把这几株菌株进行大规模的发酵培养并研发Bt粉剂与油剂，在进行科学的田间试验后逐步推向市场，这将会大大提高我国对椰子织蛾的防控效果，促进林业害虫的生物防治技术的稳步发展。

参考文献

蔡吉林, 束长龙, 宋福平, 黄勃, 张杰, 2013. 对小菜蛾协同增效的cry1和cry9类蛋白组合的筛选. 植物保护, 39(1): 66-70.

崔树松， 仪登霞, 杨丽梅, 方智远, 刘玉梅, 庄木, 张扬勇, 孙培田, 2013.cry1Ac青花菜对小菜蛾的抗性和产卵行为的影响. 中国蔬菜 (16): 43-48.

李后魂, 尹艾荟, 蔡波, 李伟东, 卢兆山, 2014. 重要入侵害虫——椰子木蛾的分类地位和形态特征研究(鳞翅目, 木蛾科). 应用昆虫学报, 51(1): 283-291.

刘楠, 王少丽, 宋福平, 束长龙, 高继国, 张杰, 2010. cry1Ba3 、cry1Ia8蛋白对cry1Ac抗性小菜蛾的杀虫活性研究. 植物保护, 36(2): 66-70.

刘向蕊, 吕宝乾, 金启安, 温海波, 李朝绪, 阎伟, 彭正强, 冯雨艳, 李晓飞, 2014a. 新入侵害虫椰子织蛾飞行能力测定. 热带作物学报, 35(8): 1610-1614.

刘向蕊, 吕宝乾, 金启安, 温海波, 阎伟, 彭正强, 冯雨艳, 方旭元, 2014b. 5种杀虫剂对入侵害虫椰子织蛾的室内毒力测定. 生物安全学报, 23(1): 13-17.

倪万潮, 张震林, 郭三堆, 1998. 转基因抗虫棉的培育. 中国农业科学, 31(2): 8-13.

宋福平, 张杰, 黄大昉, 谢天健, 杨自文, 戴莲韵, 李国勋, 1998. 苏云金芽胞杆菌cry基因PCR-RFLP鉴定体系的建立. 中国农业科学, 31(3): 13-18.

束长龙, 谷少华, 窦黎明, 陆琼, 张杰, 张永军, 赵虎基, 宋福平, 2007. 对小地老虎具有杀虫毒力的苏云金芽胞杆菌菌株的分离及鉴定. 植物保护, 33(5): 41-44.

苏旭东, 2005. 苏云金芽胞杆菌菌株的分离和cry基因的鉴定. 硕士学位论文. 保定: 河北农业大学.

武怀恒, 万鹏, 黄民松, 2014. 毒力回归计算方法及相应软件使用介绍. 安徽农业科学 (27): 9335-9338.

阎伟, 吕宝乾, 李洪, 李朝绪, 刘丽, 覃伟权, 彭正强, 骆有庆, 2013. 椰子织蛾传入中国及其海南省的风险性分析. 生物安全学报, 22(3): 163-168.

朱勋, 吴青君, 张友军, 刘春光, 刘岩林, 余亚军, 景伟, 薛原, 杨峰山, 2011. 小菜蛾高效Bt菌株的分离、生化特性及基因型鉴定. 应用昆虫学报, 48(2): 285-290.

Gassmann A J, Petzold-Maxwell J L and Clifton E H, 2014. Field-evolved resistance by western corn rootworm to multipleBacillusthuringiensistoxins in transgenic maize.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 111(14): 5141-5146.

Narva K E, Payne J M and Schwab G E, 1991.NovelBacillusthuringiensisMicrobesActiveAgainstNemotodesandGenesEncodingNovelNemotodesActiveToxinsClonedFromBtIsolates. EP 0462721A2.

Sambrook J, Fritsch E F and Maniatis T, 1989.MolecularCloning:ALaboratoryManual. 2nd ed. Cold Spring Harbor NY: Cold Spring Harbor Laboratory.

Shivashankar T, Annadurai R S, Srinivas M, Preethi G, Sharada T B, Paramashivappa R, Rao A S， Prabhu K S， Ramadoss C S, Veeresh G K and Rao P V S, 2000. Control of coconut black-headed caterpillar (OpisinaarenosellaWalker) by systemic application of ‘Soluneem’ — A new water-soluble neem insecticide formulation.CurrentScience, 78(2): 176-179.

Venkatesan T, Jalali S K, Srlnivasa Murthy K, Rabindra R J and Rao N S, 2003. A novel method of field release ofGoniozusnephantidis(Muesebeck), an important primary parasitoid ofOpisinaarenosellaWalker on coconut.JournalofBiologicalControl, 17(1): 79-80.

Venkatesan T, Kumar Jalali S and Srinivasa K, 2009. Competitive interactions betweenGoniozusnephantidisandBraconbrevicornis, parasitoids of the coconut pestOpisinaarenosella.InternationalJournalofPestManagement, 55(3): 257-263.

(责任编辑:郭莹)

Identification ofBacillusthuringiensisand insect activity against

OpisinaarenosellaWalker

Xiao-dong SUN1,2, Wei YAN1, Chao-xu LI1, Li LIU1, Wei-quan QIN1*

1CoconutResearchInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Wenchang,Hainan571339,China；2CollegeofLifeSciences,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin,Heilongjiang150030,China

Abstract:【Background】 The biological activity of Bacillus thuringiensis (Bt) strains collected from soil samples was tested against Opisina arenosella Walker, in order to obtain high insect activity strains that may help control the species. The second objective of this study was to provide new genetic resources for transgenic plant of Bt that could be more resistant to this species. 【Method】 Soil samples were collected from different areas of Hainan Province potentially suitable for O. arenosella. The temperature screening method was used to isolate Bt strains, which were then identified based on their morphology and molecular biology. The toxicity of Bt strains to larvae of O. arenosella was tested by leaf immersion bioassay method. 【Result】 Eight Bt isolates were obtained from Baoting soil samples, Hainan Province. The 8 Bt isolates included bipyramidal crystal, spherical crystal, square crystal types. PCR-RFLP analysis showed that Cry1, cry1I and cry2 type genes were present in these isolates, but the cry gene-types of two isolates were unknown. The toxicity of the extracted insecticidal crystal proteins (ICP) of the 8 strains against larvae of O. arenosella was assayed. The results indicated that the use of ICP of BAT10 (50 μg·mL(-1)) resulted in 100% mortality of the larvae. ICP of 29-15-4 and BAT20 resulted in more than 80% mortality while the ICP of the other five strains showed less than 50% mortality. 【Conclusion and significance】 This study showed that effective Bt strains could be found in soil potentially suitable to O. arenosella and among them, two strains had the potential to be used as biological control against this species.

Key words:Bacillus thuringiensis； Opisina arenosella Walker; identification； bioactivity

DOI:10. 3969/j.issn.2095-1787.2016.01.011

作者简介:孙晓东， 男， 博士研究生， 助理研究员。 研究方向： 棕榈植物病虫害防治。 E-mail: sxd1949@163.com.*通讯作者Corresponding author, E-mail: qwq268@163.com

基金项目:海南省重大项目(ZDZX2013008)； 海南省重点项目(ZDXM20130049、ZDXM20130004)； 海南省基金(311091)； 中国热带农业科学院基本科研业务费(1630041014002)

收稿日期(Received)： 2015-05-09接受日期(Accepted)： 2015-06-21