屎肠球菌微胶囊制剂的稳定性及对断乳仔猪生产性能的影响

李英英　陈　曦　宋铁英（福建省农业科学院生物技术研究所　福州　350003）



屎肠球菌微胶囊制剂的稳定性及对断乳仔猪生产性能的影响

李英英陈曦宋铁英※
（福建省农业科学院生物技术研究所福州350003）

摘要本试验以自主筛选的一株屎肠球菌为对象，在抗逆性评估的基础上，通过微囊化提高耐热性和稳定性，并进行动物田间小试，评价其对断乳仔猪生长性能的影响。结果显示，通过优化保护剂与壁材的配方，改善喷雾干燥工艺参数，可使喷雾后获得的干物质中活菌数达到10(10)cfu/g；微囊化的屎肠球菌对高温的耐受性增强，贮存时间更久，对胃液和肠液依然具备较好的耐受性。在仔猪生长性能方面，与空白组相比，饲喂屎肠球菌组仔猪的平均日增重和日采食量分别提高37%和15%，料肉比和腹泻率分别下降16%和65%，说明该屎肠球菌微胶囊制剂可以改善仔猪生长性能。

关键词屎肠球菌微胶囊制剂稳定性断乳仔猪生产性能

The stability of microencapsulated Enterococcus faecium probiotics and effects on growth performance of weaned piglets

Li Yingying Chen Xi Song Tieying*
(Institute of Biotechnology,Fujian Academy of Agricultural Science,Fuzhou 350003)

Abstract In this study,one strain of Enterococcus faecium from the preliminary work was investigated on its resistances and further be microencapsulated to improve the thermostability and storage stability.A pilot filed experiment was proceeded to evaluate its effect on the piglet growth performances.The results indicated that the amount of bacteria reach at the levels of 1010cfu/g after the optimization of protective agent,wall material,and process parameters.No change on the tolerance to succus gastricus and succus entericus but much better thermostability and storage stability were achieved by microencapsulated E.faecium.According to the result of the field experiment,the average daily gain (ADG) and average daily feed intake (ADFI) in E.faecium group were increased by 37% and 15%,respectively,while the feed conversion ratio (FCR) and total diarrhea times were reduced by 16% and 65% when compared to the control group,indicating the improvement on the growth performances by E.faecium.

Key words Enterococcus faecium microencapsulated probiotics stability weaned piglets growth performance

长期以来，人们依靠添加抗生素来降低断乳时期仔猪的应激反应，从而维持断乳仔猪的健康，但是滥用抗生素又引发药物残留和耐药性的问题，因此，寻找抗生素的替代品成为养殖业亟待解决的问题[1]。乳酸菌制剂具有抑制肠道病原菌、改善肠道环境、促进消化吸收、降低料重比、提高动物免疫力、降低粪便污染等多种作用，是最具发展潜力的抗生素替代品之一[2]。但是，将乳酸菌直接添加于饲料中，常存在着菌株不耐饲料制备时的高温、不耐储存、对动物的胃肠液耐受性差等问题[3-5]。因此，常采用微胶囊包被技术来提高益生菌在加工和储藏过程中的成活率，并同时增强菌株对高温和胃肠液的耐受性[6-9]。

屎肠球菌是乳酸菌中抗逆性较强[10]、培养和保存条件都较为容易的一类菌，因此，是制作乳酸菌微胶囊制剂时的首选菌种[1]。本研究以前期研究中筛选分离的猪源屎肠球菌为基础，通过优化后的包被配方和喷雾工艺制备微胶囊制剂，探讨包被前后其在高温耐受性、耐酸性、肠溶性和稳定性等生物活性方面的变化，并将微胶囊制剂添加于饲料中进行田间动物小试，以评估该微胶囊的包被效果及实际的临床应用效果。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验菌株由本实验室在福建省某猪场周边土壤自主分离到的屎肠球菌BBH201305001，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，菌种保藏代号：CGMCC No.8296。

1.1.2试验动物21.0±2.6日龄、体重在7.1±0.26 kg的大三元断乳仔猪50头。

1.1.3试剂

人工肠液：取KH2PO46.8 g，加水500 mL溶解，用0.4%NaOH调节pH至6.8；另取胰酶10 g加水适量使溶解，将两溶液混合后，加水定容至1 L。

人工胃液：取稀HCl 16.4 mL，加水约800 mL及胃蛋白酶10 g，搅匀后加水定容至1 L。

MRS培养基：麦芽糖5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g,磷酸氢二钾2 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，柠檬酸三胺2 g，吐温-80 1mL，加水至l L，调节pH至6.5。

卵黄粉：由福建省金华龙饲料有限公司提供。

1.2试验方法

1.2.1屎肠球菌稳定性检测

1.2.1.1屎肠球菌的高温耐受性检测取保藏的屎肠球菌接种于MRS培养基中，37℃、200 rpm/min培养16～20 h复苏，取复苏后菌液1 mL，分别置于50、80、100℃下，30、60 min后取出，进行涂板计数。

1.2.1.2屎肠球菌的贮存稳定性检测取复苏后菌液1 mL，置于47.5℃下，7 d后取出进行涂板计数。1.2.1.3屎肠球菌的耐酸性试验取复苏后菌液0.1 mL，加入0.9 mL人工胃液中，37℃、200 rpm/min下放置30、60、90、120 min后取出涂板计数。

1.2.1.4屎肠球菌的肠溶性试验取复苏后菌液0.1 mL，加入0.9 mL pH6.8的人工肠液中，37℃恒温水浴搅拌，37℃、200 rpm/min条件下放置，分别在30、60、90、120 min后取出进行涂板计数。

1.2.2屎肠球菌微胶囊制剂的制备将屎肠球菌菌种接种于MRS液体培养基，37℃、200 rpm/min培养16 h，成为种子液；将种子液按1%比例接种于发酵罐中扩大培养，37℃、200 rpm/min厌氧条件下培养20 h。

向获得的发酵液中加入干燥保护剂（阿拉伯胶5%，β-糊精15%、蔗糖3%、淀粉7%）和卵黄粉，添加方式为：先向发酵液中加入0.5%吐温-80，再加入10%卵黄粉，边加边搅拌；然后缓缓加入干燥保护剂，边加边搅拌，直至混匀制成菌液混合物，继续搅匀后进行喷雾干燥制成菌粉。

喷雾干燥工艺指标：进口温度控制在155～165℃，出口温度控制在50～70℃，风压指数控制在25～30 Mpa，喷雾头变频为400 Hz。

1.2.3屎肠球菌微胶囊制剂的稳定性检测取制备好的屎肠球菌微胶囊制剂，加无菌水10倍稀释，振荡使其完全溶解后取稀释液按照1.2.1.1-1.2.1.4提供的方法检测其稳定性。

1.2.4屎肠球菌微胶囊制剂的田间小试试验在福建省闽清县后洋养猪场进行，将50头断乳仔猪随机分成两组，分别为试验组和对照组，试验组日粮中按0.3‰比例添加制备好的屎肠球菌微胶囊制剂，对照组中不添加。从22日龄断乳开始试验，持续2周；试验期间按常规饲养管理，提供足量的清洁饮水和饲料，自由采食，所用饲料为福建省金华龙饲料有限公司所提供的猪宝宝断乳仔猪教槽料。

2　结果与分析

2.1屎肠球菌与屎肠球菌微胶囊制剂的生物稳定性比较

2.1.1屎肠球菌与屎肠球菌微胶囊制剂的高温耐受性比较屎肠球菌在50～100℃下，该菌株在30 min后均无存活。而制成微胶囊后，其存活率显著提高，50℃下60 min后可达95%，80℃下30 min后依然有50%存活率。因此，认为该菌株对高温的耐受性较差；微囊化后，提高了该菌的高温耐受性（见表1）。

表1　不同温度热处理菌液和微胶囊制剂后屎肠球菌存活率比较

2.1.2屎肠球菌与屎肠球菌微胶囊制剂的贮存稳定性检测结果将菌液在47.5℃下避光存放7 d后，菌液中未发现活菌。而屎肠球菌微胶囊制剂在47.5℃下放置7 d后，检测到样品中的屎肠球菌存活率为45%（见表2）。

表2　屎肠球菌菌液和微胶囊制剂贮存稳定性结果比较

2.1.3屎肠球菌及屎肠球菌微胶囊的耐酸性检测结果见表3，菌液和微胶囊制剂经人工胃液处理120 min后屎肠球菌存活率依然较高，说明该菌株自身对于胃酸及胃蛋白酶具有较好的耐受性，而在制备微胶囊后，其耐受性未发生改变。

表3　人工胃液处理菌液和微胶囊制剂后屎肠球菌存活率比较

表4　人工肠液处理菌液和微胶囊制剂后屎肠球菌存活率比较

2.1.4屎肠球菌及微胶囊肠溶性检测结果见表4，菌液和微胶囊制剂经人工肠液处理120 min后屎肠球菌存活率依然较高，因此，认为该菌株自身对于胰酶具有较好的耐受性，而在制备微胶囊后，其耐受性未发生改变。

2.2屎肠球菌微胶囊田间小规模试验结果见表5，可以看出，添加屎肠球菌微胶囊的试验组与空白对照组相比，平均增重、采食量分别提高37%和15%，料肉比和腹泻率分别下降16%和65%。

表5　田间小规模试验结果

3　讨论

3.1屎肠球菌微胶囊制剂的稳定性检测益生菌添加于饲料中，存活率是影响其作用的关键因素[11]。本试验通过筛选抗逆性较好的菌株、改良培养基、调整保护剂与壁材配方、改善喷雾干燥工艺参数，使制备的屎肠球菌微胶囊活菌数达到109-10cfu/g，高于益生菌制剂所要求的有效活菌量3.8×108cfu/g[12]；同时，对微囊化前后的屎肠球菌进行高温耐受性、贮存稳定性、肠溶性及耐酸性试验，结果表明：微囊化的屎肠球菌对温度的耐受性提高，可以耐受短时间的高温，这样更有利于其在饲料中的应用和自身的贮存；所选用的菌株在微囊化前后对胃液和肠液都有较好的耐受性，使动物饲用该制剂后到达肠道时仍有较高的活菌量。说明本试验所选用的菌株及所采用的微胶囊制备方法适合制备屎肠球菌微胶囊制剂。

3.2屎肠球菌微胶囊田间小规模试验在断乳仔猪保育阶段，由于仔猪消化道发育尚未完全，免疫系统亦不完善，断乳后抗病力低，断乳引起的应激常导致腹泻，严重影响仔猪的生长。而乳酸菌是肠道的益生菌，在动物体内既能抑制病原菌生长、增强机体免疫力，又能增强营养物质的吸收，促进动物生长[13-14]。因此，若在断乳仔猪日粮中添加乳酸菌，可增加其肠道内益生菌数量，改善肠道微生态环境，从而增强免疫力，降低腹泻率，促进生长[1]。本试验将制备的屎肠球菌微胶囊以0.3‰剂量添加于断乳仔猪日粮中，与饲喂同样日粮但不添加屎肠球菌微胶囊的空白对照组相比，试验组仔猪料肉比和腹泻率明显降低，平均增重和采食量有明显提高，说明本试验制备的屎肠球菌微胶囊对于断乳仔猪具有明显的促生长和降低腹泻率的作用，具有较强的应用前景和实用价值。

4　结　论

通过筛选抗逆性较好菌株、改善工艺参数及配方等方法，所得到的屎肠球菌微胶囊制剂活菌数较高，可在一定的条件下保存一段时间，同时在田间小规模试验中取得了较好的效果，这为屎肠球菌微胶囊的制备及在动物日粮中的推广应用都提供了一些参考数据。

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通信作者：＊宋铁英（1963-），女，研究员，主要从事动物营养新技术研究。E-mail:tieyingsong@163.com。

作者简介：李英英（1987-），女，硕士，研究实习员，主要从事动物营养新技术研究。E-mail:liyingying80@126.com。

基金项目：福建省科技计划项目(2014R1019 -12、2014R1019-5、2015R1019-9)、福州市科技计划项目(2014-N-106)、福建省农科院青年创新人才基金(2014CX-11)资助。

文献标识码：A

文章编号：1003-4331（2016）02-0014-04