cDNA-AFLP分析不同发育时期蓖麻种子脂肪酸差异基因表达的关键技术

陈晓凤，黄凤兰*，赵 永，姜桐桐，李佳会，周婷婷，常旭丰，刘佳琪

(1.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽 028000；2.内蒙古自治区高校蓖麻产业技术研究中心，内蒙古通辽 028000；3.内蒙古自治区蓖麻育种重点实验室，内蒙古通辽 028000)



cDNA-AFLP分析不同发育时期蓖麻种子脂肪酸差异基因表达的关键技术

陈晓凤1，2，3，黄凤兰1，2，3*，赵 永1，2，3，姜桐桐1，2，3，李佳会1，2，周婷婷1，常旭丰1，刘佳琪1

(1.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽 028000；2.内蒙古自治区高校蓖麻产业技术研究中心，内蒙古通辽 028000；3.内蒙古自治区蓖麻育种重点实验室，内蒙古通辽 028000)

摘要在介绍cDNA-AFLP技术原理与操作步骤的基础上，分析了应用cDNA-AFLP分子标记技术分析蓖麻种子脂肪酸含量差异基因表达过程中的主要影响因素，以期为后续利用该标记技术分析不同发育时期蓖麻种子脂肪酸含量的差异表达提供技术支持。

关键词cDNA-AFLP；蓖麻；差异基因表达

cDNA-AFLP Analysis of Key Technique on Various Gene Expressions of Different Developmental Time Castor Seed Fatty Acid

CHEN Xiao-feng1,2,3, HUANG Feng-lan1,2,3*, ZHAO Yong1,2,3et al

(1. College of Life Science, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao, Inner Mongolia 028000; 2. The Inner Mongolia Autonomous Region University Castor Industry Technology Research Center, Tongliao, Inner Mongolia 028000; 3. Inner Mongolia Key Laboratory of Castor Breeding,Tongliao, Inner Mongolia 028000)

AbstractBased on introducing principle and operation steps of cDNA-AFLP technology, the key influencing factors of using cDNA-AFLP molecular marker technology in gene expression research process of different fatty acid content in castor seed were analyzed, so as to provide technical support for subsequent researches on using this molecular maker technology in anslysis of different fatty acid content in different developmental time castor seed.

Key wordscDNA-AFLP; Castor; Differential gene expression

蓖麻(Ricinusconununis)为大戟科蓖麻属双子叶植物，是一种重要的油料作物[1]，其适应范围广，综合利用价值高，广泛应用于医药、化工、机械、航空航天等行业。蓖麻种子脂肪酸含量较高，种仁中油脂含量高达60%～70%，提高种子含油率具有重要的实践意义[2-6]。

cDNA-AFLP技术是基于AFLP技术建立起来的，与RT-PCR技术结合后用于分析mRNA表达情况，具有灵敏性高、假阳性率低等优点，可显著标注基因差异表达，最大限度地提供基因编码区不同性状的差异信息。因此，掌握该技术的原理和实际操作过程中的关键步骤，有助于研究蓖麻种子脂肪酸含量的差异表达。笔者介绍了应用cDNA-AFLP分子标记技术分析蓖麻种子脂肪酸差异基因表达研究过程中的主要影响因素，以期为后续利用该标记技术分析不同发育时期蓖麻种子脂肪酸含量的差异表达提供技术支持。

1cDNA-AFLP技术原理与操作步骤

AFLP标记技术是一种限制性选择PCR扩增基因片段的方法，即建立mRNA差异显示技术。高等生物成熟时，mRNA具有特异的polyA结构特征，分离、纯化mRNA后与专一的锚定引物反转录cDNA，再结合AFLP技术对其进行选择性扩增，以达到差异基因的分离[7]。mRNA差异显示技术不仅保留了AFLP技术的诸多优点，且具有重复性好、准确性高、效率更加显著等优点，可对生物体转录组进行更加全面、系统的分析，能反映基因间表达量的差异[8]。根据起始材料的不同分为DNA-AFLP、cDNA-AFLP。cDNA-AFLP技术已成功用于分析特异表达基因杂种优势遗传机理的研究、表达基因的遗传连锁作图、基因功能标记分析、基因表达特性研究等方面[9-10]。

cDNA-AFLP技术第一步是获得高质量的试验材料，第二步是利用双高频限制性内切酶酶切基因组或RNA，第三步是酶切产物与人工合成特定序列的双链接头连接，第四步是以加锚2～3个特异选择性碱基的引物对连接产物进行选择性PCR扩增，最后一步是电泳分离差异表达基因。在整个研究过程中，所加锚的碱基种类、数目或顺序决定了PCR扩增产物的特异性，仅有接头侧翼碱基与所加锚的几个选择性碱基相匹配的基因片段，才符合被扩增要求，根据该特点可设计特异性引物，能最大程度地满足试验要求(图1)。

图1　cDNA-AFLP技术流程Fig.1　The technical process of cDNA-AFLP

2cDNA-AFLP技术分析不同发育时期蓖麻种子脂肪酸差异基因表达的操作要点

2.1蓖麻种子总RNA的提取高质量总RNA的提取以及其完整性，是该试验的关键性问题之一。实验室常用的提取方法有CTAB法和TRIZOL法。但这2种方法在提取过程中常导致RNA中出现杂质而降低纯度。不同发育时期蓖麻种子脂肪酸差异基因表达研究中使用北京庄盟公司生产的植物总RNA提取试剂盒，是广谱型RNA提取试剂盒，该试剂盒克服了上述缺点，具有成本较低、操作快速、提取时分层及颜色对比明显的特点，且不易受多糖、酚类等物质的影响，保证了RNA的完整性及纯度(图2)。

图2　植物总RNA提取试剂盒提取蓖麻种子总RNAFig.2　Total RNA of castor seed extracted by plant total RNA extraction kit

2.2cDNA合成质量与双酶切对扩增效果的影响cDNA合成过程中，由于多糖、酚、酮类化合物的存在，或是频繁过度的高速离心等操作过程都会导致一些遗传序列信息的丢失；也有可能是转录过程中并不是全部的表达信息进行翻译，造成部分低丰度基因的损失。该研究双链cDNA的合成采用的是TaKaRa的合成体系，可获得高质量、高浓度的片段，降低了因基因丢失对下一步试验的影响。

cDNA-AFLP技术中，双内切酶组合的选择至关重要，一般采用双酶切组合，且其组合应最大限度地覆盖基因池，酶切时间要适中，连接酶要高效，产物片段能够顺利地与接头进行连接，避免酶切片段间自连而产生假象，保证酶切完全、彻底(图3)。

图3　cDNA酶切结果Fig.3　The result of restriction enzyme digestion of cDNA

2.3cDNA-AFLP技术两步PCR扩增扩增引物的选择是PCR成功的关键，也是cDNA-AFLP技术整个试验过程成败的关键因素之一，引物长度在15～20 bp大小为宜，引物3′端选择性碱基数目、种类决定扩增的特异性。而选择性碱基的G、C含量对扩增产物的数目也有影响，G+C含量在40%～60%为宜，尤其引物内部在3′端最好不产生二级结构。

在PCR扩增体系和程序中，模板浓度对体系稳定性影响较大，合适的稀释倍数是扩增成功的关键。稀释倍数较小，引物或dNTP会很快被耗尽，遗传信息不能够得到完全复制，影响其完整性，且在电泳时会出现严重的拖尾现象；稀释倍数过大，低浓度的模板会导致扩增效果不明显甚至难以检测到，电泳中未见条带或者条带模糊不清，从而造成遗传信息丢失，不利于后续试验对基因差异的检测、分离。

2.4cDNA-AFLP反应体系、反应程序的优化分别对种子总RNA的提取、双酶切时间、预扩增、选择性扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳条件进行了优化，建立了适于分析蓖麻种子中脂肪酸含量差异基因表达的cDNA-AFLP技术体系。第一，RNA的提取必须在无菌环境即超净工作台内进行，操作人员须佩戴口罩，防止口腔内各种酶干扰提取过程，操作过程中尽可能减少人员流动；第二，因该研究对双酶切的要求是同时具有2个必要的限制性内切酶识别位点，因此对于酶的选择至关重要，MseI/EcoRI的酶切组合均是高频限制性的，可最大可能地覆盖基因片段，产生更广的酶切结果，有利于后续扩增得到更多更特异性的基因；第三，预扩增、选择性扩增是得到差异片段的中间环节，因此，最合适的体系与程序相结合很关键，利用五五均匀设计法优化，得到最佳的反应程序与体系；第四，分离差异基因的最后一步是聚丙烯酰胺凝胶电泳，该步骤耗时较长，整个试验过程的费用较高，因此要注意凝胶时间、电压大小和时间长短、银染程度等因素。

图4　cDNA-AFLP分析蓖麻种子脂肪酸差异表达基因的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果Fig.4　cDNA-AFLP analysis of polyacrylamdide gel of various gene expressions of castor seed fatty acid

2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，胶体的凝聚程度，电泳的电压大小、时间长短，染液的浓度，固定、银染、显影的时间以及显色程度等都能够影响差异基因的筛选。亲和硅烷和剥离硅烷的滴加量要适当，当聚丙烯酰胺凝胶凝聚不完全或凝聚过久，会在剥离胶板时出现破碎等现象；电压过高会使条带不明亮、基因信息跑出胶板导致丢失，电压过低则会导致电泳时间过长从而分离效果不明显，所需基因信息降解以致于不能得到完全分离；银染全过

程必须使用ddH2O，否则混杂的其他离子会严重影响银离子染色及显色效果；显色液必须现配现用，显色时必须加甲醛且不能提前加。cDNA-AFLP分析蓖麻种子脂肪酸差异表达基因的聚丙烯酰胺凝胶电泳效果见图4。

3展望

cDNA- AFLP技术反应条件虽然严谨，但却能集中显示基因组表达序列的多态性差异，对mRNA的转录均等扩增，可有效地找到目的基因。研究转录水平基因表达的目的之一是分离该基因并进一步研究该基因的功能和对生物个体发育的影响，cDNA-AFLP 和dd-PCR的结合更适合差异基因的分离，已逐渐成为基因表达模式研究的有效手段之一，也是研究功能基因组的新方法、新手段，并已显示出巨大的应用潜能。cDNA-AFLP技术必将在全面了解基因表达和后基因组计划中发挥巨大作用。

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中图分类号S 188

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)06-177-02

收稿日期2016-01-28

作者简介陈晓凤(1990- )，女，内蒙古赤峰人，硕士研究生，研究方向：蓖麻分子育种。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事蓖麻分子育种研究。

基金项目内蒙古民族大学研究生科研资助项目(NMDSS1467)；国家自然科学基金项目(30760123，31160290，31460353)；内蒙古自治区高等学校“青年科技英才支持计划”(NJYT-14-A10)；内蒙古自治区科技创新引导项目；内蒙古自治区“草原英才” 计划项目；市校合作项目(SXZD2012018，SXZD2012017，SXZD2012006)。