利用拟南芥水培体系研究根部矿质养分对叶钙积累的作用

姚宏伟，张丽娟 ，王雪骄，祁 智 ，杨 菊

（1.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010021；2.内蒙古师范大学附属中学，内蒙古呼和浩特 010021）

钙是衡量牧草营养价值的重要标准，牧草营养价值的高低在一定程度上取决于钙的含量。在维持奶牛的生命和产奶过程中需要大量的钙，钙也是奶牛乳汁的重要组成成分。程建波等研究表明钙能显著地提高奶牛的产奶量和乳脂率，也可以提高其他乳蛋白含量[1]。钙能够改善泌乳期奶牛能量负平衡，减少体重下降[2]。在植物体内，钙是维持细胞壁硬度以及细胞膜结构与功能的重要离子[3]。大量研究表明在诱发应对多种生物和非生物胁迫过程中Ca2+是一个重要的信使分子[4-5]。在植物体内几乎所有的信号传递（发育的，激素的，胁迫的）都首先引起细胞质内Ca2+水平的变化，在某些情况下会发生在细胞核和其他细胞器中[6]。许多研究已经证明提高细胞质或细胞核内Ca2+水平，通过Ca2+感受器能够直接或间接地调控基因的表达[7-8]。当植物受到生物或非生物胁迫时，体内的Ca2+或钙调蛋白结合转录因子，调控基因的表达，以此来面对不利的环境[9-10]。

植物根从土壤中吸收矿质养分，通过质外体途径和共质体途径将矿质养分运输到植物体各个组织和器官，满足植物生长发育的需求。研究表明中国土壤退化问题日益严重，土壤侵蚀，盐碱化，荒漠化，贫瘠化，潜育化，土壤污染都会对土壤矿质元素组分和含量造成影响[11]。本试验以正常生长基本培养液的植株为对照，分别用 Ca2+、K+、NO3-、Mg2+、SO42-、NH4+、PO43-、Fe2+、Zn2+，不同离子浓度的溶液进行处理，用原子吸收仪来测定植物体叶内钙的积累水平，观察植物体内钙水平的变化，探究了矿质元素的不同离子浓度对拟南芥叶钙积累作用。

1 材料和方法

1.1 植物材料准备

拟南芥（Arabidopsis thaliana，ecotype Columb ia），本实验室保存。拟南芥种子用75%乙醇进行表面消毒10 min，在超净台中将灭菌好的滤纸折成船状，倒掉75%乙醇，再加入100%的乙醇，然后将种子倒在滤纸上，等酒精挥发后，将12～15粒种子均匀播种到灭菌培养基上（基本溶液+1%糖+1%琼脂），4°C春化3 d，然后放到光照培养室［光强（75～100 μmol/m2·s） 光照（16 h 光照，8 h 黑暗），温度（22±1℃）］培养，先竖直培养14 d，然后根向上放置7～10 d，使植物的根长在培养基表面。

1.2 基本培养液的成分及配制

大量元素：5 mM KNO3，1 mM H3PO4，1 mM MgSO4，1 mM CaCl2，5 mM MES；微量元素：MS 微量元素（0.5×），MS Fe盐（0.5×），用 HCl或 KOH 调节pH值至5.7；研究K时，用HCl或BTP调节pH值至5.7。

1.3 试验方法

1.3.1 植物材料处理 拟南芥种子在光照培养室中生长21 d左右，用蒸馏水清洗植物根部，然后移植到含有基本培养液的水培体系中，植物根部浸泡在培养液中水培盒的孔壁支撑并固定植株使叶片无法接触到培养液，然后将移植好的植株放在光照培养室中继续培养，生长约20 d后，用9种不同离子浓度的溶液进行处理。

1.3.2 离子浓度梯度处理 拟南芥生长25 d后，用蒸馏水小心清洗植株的根，将营养液冲洗干净，再用9种不同离子浓度的溶液进行处理。处理条件如下：Ca2+，离子浓度分别为 0，1，20mmol/L；K+，离子浓度分别为 0，5，30mmol/L；NO3-，离子浓度分别为 0，1 ，20mmol/L；Mg2+，离子浓度分别为 0，1，20mmol/L；SO42-，离子浓度分别为 0，1，10mmol/L；NH4+，离子浓度分别为 0，10mmol/L；PO43-，离子浓度分别为 0，1，10mmol/L；Fe2+，离子浓度分别为 0.001 115，0.0 223，0.223mmol/L；Zn2+，离子浓度分别为 0.00 075，0.015，0.15mmol/L。使用预先经过清洗和121℃高压蒸汽灭菌的水培盒，每个处理使用2个水培盒（每盒约12株苗），然后将植株放回光照培养室，处理时间为4 d。

1.3.3 不同离子浓度对拟南芥叶钙积累的影响 将处理好4 d的植株取出，用剪刀将植株根部以上的部分剪下，3株或4株为一组，称鲜质量并记录，然后用蒸馏水小心清洗植株，放入设置为80℃的烘箱中，5 d后，取出样品称干质量并记录数据。

1.3.4 Ca2+含量的测定 将烘干的植株研磨成粉末，加入到离心管中，再加入1.9 mL的1%的HCl，用涡旋振荡仪混匀，置于37℃温箱消化48 h，离心（15 000 r/min），取上清液 1.5 mL，用 TAS-990 原子吸收仪测定Ca2+浓度，测定波长为422.7 nm，钙的标准品［国家级标准品GBW（E080118）］。

2 结果与分析

2.1 构建拟南芥的水培体系

拟南芥水培体系的构建（图1），水培盒是32孔离心管盒子（图1a），将“黑色自贴壁纸（图1c）”贴在盖子（图1b）上，在壁纸上打出大小适宜的孔，再将一定量的基本培养液加入到水培盒中，盖上盖子，将植株从培养皿（图1d）中移到水培盒上，植株架在孔上，根浸在基本培养液中（图1e），根部以上不会接触到培养液，将带有植株的水培盒放入有机玻璃大盒子中（图1f），盖上玻璃盖来保持湿润，待植株长大后适时打开玻璃盖，植株可以在水培盒上完成生活史。研究明拟南芥水培不需要连接通气泵，通气之后植株容易出现胁迫的症状。为了避免污染的积累，每隔7 d换一次培养液，若污染较严重，则换掉水培盒。

2.2 不同矿质元素对拟南芥叶内钙积累的作用

矿质元素的不同离子浓度对拟南芥叶钙的积累具有不同的影响，如图2所示，当外界的Ca2+浓度升高或降低时植株体内钙含量并没有发生显著地变化。当外界的NH4+浓度为10mmol/L时，植株的钙含量显著地下降。植株在 NO3-浓度 CK（5mmol/L），低浓度（0mmol/L），高浓度（30mmol/L）3种处理下，钙含量分别达到 2 106.59 μg/g，1 982.78 μg/g，2 139.76 μg/g，在低浓度下，钙含量有下降的趋势，在高浓度下，钙含量有升高的趋势，然而实验结果并不显著。在K+浓度为 CK（5mmol/L），低浓度（0mmol/L），高浓度（30mmol/L）3种处理下，低浓度下的植株钙含量显著地增加，而在高浓度下，植株钙含量并没有发生显著性变化。在SO42-、PO43-、NO3-3种离子的高浓度和低浓度处理下植物体内的钙含量并没有发生显著的变化。在 Mg2+、Fe2+、Zn2+低浓度和高浓度处理下，植物体内的钙含量都出现了显著的下降。

3 结论与讨论

有研究表明，NH4+对Ca2+的吸收存在拮抗作用，引起钙吸收障碍[12-13]，使植物体内钙积累量降低，本实验结果也表明NH4+对Ca2+的吸收存在拮抗作用。植株在 NO3-浓度为 CK（5mmol/L），低浓度（0mmol/L），高浓度（30mmol/L）3种处理下，钙含量分别达到 2 106.59 μg/g，1 982.78 μg/g，2 139.76 μg/g，在低浓度下，钙含量有下降的趋势，在高浓度下，钙含量有升高的趋势，然而实验结果并不显著，这可能由于植株吸收了NO3-，在体内NO3-转化成NH4+和其他有机形态，因此需要更多的时间才能对植物钙含量产生影响。研究低氮营养对草莓苗矿质元素吸收的影响[14]，结果显示，随氮素浓度的增加，草莓叶钙的含量呈现出先下降后上升的趋势，与本次实验结果一致。

在 K+浓度为 CK（5mmol/L），低浓度（0mmol/L），高浓度（30mmol/L）3种处理下，低浓度下的植株钙含量显著地增加，而在高浓度下，植株钙含量并没有发生显著性变化。有研究表明在吸收上K+对Ca2+表现为拮抗作用[15]，当K+不存在时，有利于钙的吸收，从本实验结果上看，K+浓度为0mmol/L时，钙含量显著下降，这与上述的研究结果类似，当K+浓度为30mmol/L时，并没有显示出抑制钙吸收的作用，同一元素对不同植物的作用不同可能是结果不显著的原因。

在对切花月季的研究中[16]，当切花月季长期处于高磷的环境下会阻碍植株吸收和代谢钙，铁，铜，锌等元素。在本实验中，在SO42-和PO43-浓度梯度的处理下，植株体内的钙含量并没有表现出显著的变化，可能是由于SO42-和PO43-浓度的变化影响植株体内与钙积累无关的生理代谢反应，使植株的钙含量没有发生显著的变化，也有可能是由于影响钙积累的速率比较慢，使结果并不明显。

不同元素之间的关系十分复杂，SO42-与Ca+2，PO43-与Ca2+之间的相互关系目前仍缺乏深入的研究。Mg2+、Fe2+、Zn2+在低浓度和高浓度下，植物体内的钙含量都出现了显著的下降。李娟等研究表明[15]，增加Mg2+的浓度会使烟叶内的钙含量出现下降的趋势，本实验中，在Mg2+高浓度处理下，钙含量出现明显的下降。植株在Mg2+低浓度（0mmol/L）处理下，钙含量下降了18%，在Mg2+高浓度（20mmol/L）处理下，钙含量下降了42%，两种处理所造成钙含量下降的幅度具有明显的差异，表明这两种处理使钙含量下降的机理是不同的，具体的机理需要进一步探究。孙桂芳、朱英华等研究表明[17-18]，铁元素过量会阻碍植物吸收钾，镁，锰，铜，导致出现其他营养元素缺乏的症状。在本试验中，高浓度的Fe2+、Zn2+使植物钙含量下降，机理尚不清楚，我们可以对其中存在的机理做出假设，假设一，高浓度的Fe2+、Zn2+直接抑制或阻碍植株对Ca2+的吸收，直接造成钙含量的下降。假设二，高浓度的Fe2+、Zn2+抑制或阻碍植株对其他矿质元素的吸收，造成植株缺乏某种或某些种矿质元素，间接造成钙含量下降。假设三，大量的Fe2+，Zn2+进入植株体内，使某些生理代谢反应发生改变或失调，通过级联反应造成植株体内钙水平的下降。对于低浓度Fe2+、Zn2+导致植物体内钙水平下降这一现象，我们也做出假设，假设一，在一定浓度范围内的Fe2+、Zn2+可能会促进植物吸收某一种或某几种矿质元素，当Fe2+、Zn2+的浓度低于这个范围，就起不到促进的作用，使植物缺乏某一种或某几种元素，间接的造成植物体内钙含量下降。假设二，由于Fe2+、Zn2+浓度的降低，进入植株体内的Fe2+和Zn2+减少，影响某些生理代谢反应，使植物体内钙含量下降。这些假设需要进一步研究来验证。

总体来说，NH4+、K+、Mg2+、Fe2+、Zn2+这些阳离子对植物叶钙积累的影响十分显著，而SO42-、PO43-、NO3-这些阴离子对植物叶钙积累的影响并不显著，这可能暗示着植株体内存在某种生理机制使自身对大多数阳离子敏感，对大多数阴离子不敏感。在中国，土壤矿质元素的组分及含量由于土壤退化而发生很大的变化，研究不同矿质元素对植株叶钙积累具有重要的意义。

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