黑曲霉降解人参皂苷Rb1制备稀有皂苷Compound K

高　娟,　周安东,　原　野,　赵天蛟

1.东北师范大学生命科学学院, 长春130024;

2.东北师范大学附属中学, 长春 130024



黑曲霉降解人参皂苷Rb1制备稀有皂苷Compound K

高娟1,周安东2,原野1,赵天蛟1

1.东北师范大学生命科学学院, 长春130024;

2.东北师范大学附属中学, 长春 130024

摘要：稀有人参皂苷Compound K(C-K)具有显著的生物学活性。从东北农耕土壤中分离出9株真菌，系统研究了其转化人参皂苷Rb1制备C-K的能力。其中，黑曲霉Aspergillus niger sp. J7能够高效转化人参皂苷Rb1生成C-K，转化途径为Rb1→Rd→F2→C-K。对黑曲霉J7转化Rb1制备C-K的条件进行优化，在最优条件下，Rb1可完全转化成C-K。将该转化体系扩大到200 mL，60 h内可将Rb1完全转化成C-K，转化率为74.7%。黑曲霉J7为人参皂苷Rb1高效水解为稀有人参皂苷C-K奠定了基础。

关键词：人参皂苷；黑曲霉；生物转化；β-葡萄糖苷酶

人参皂苷是人参的主要活性成分之一。药理学研究表明一些稀有人参皂苷如Compound K(C-K)具有显著的抗肿瘤活性[1~4]。然而，人参皂苷C-K在天然人参中并不存在，这限制了C-K的临床应用。因此，如何制备稀有人参皂苷C-K成为目前研究的热点。对比人参皂苷的结构可知，稀有人参皂苷C-K与其他高含量的人参皂苷，如Rb1相比，其皂苷元结构相同，只是侧链上糖基的数目和种类不同[5]。因此，理论上可以通过选择性水解人参皂苷Rb1的糖基来制备稀有皂苷C-K[6~8]。目前，制备稀有人参皂苷的方法主要包括化学法和生物转化法[9,10]。化学法包括加热、部分酸水解和碱水解等，具有副产物多、产率低、污染环境等缺点，不利于其应用。基于糖苷水解酶催化的微生物转化法具有反应条件温和、专一性高、环境相容性强等优点，具有极大的应用潜力[11~13]。因此，筛选高效转化人参皂苷制备稀有人参皂苷C-K的菌株具有广阔的研究和应用前景[14~16]。本研究从东北农耕土壤中筛选出能高效转化人参皂苷Rb1制备C-K的真菌，并优化其转化条件，通过TLC、HPLC和13C-NMR进行定量分析和结构鉴定[17~19]，以期为C-K的制备奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

本试验所用土壤采集自吉林省梨树县的农耕土壤。转化底物人参皂苷Rb1由实验室制得并经HPLC和13C-NMR鉴定。人参皂苷标准品购自成都曼思特生物科技有限公司。对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(pNPG)购自Sigma-Aldrich公司。分子克隆相关试剂如Taq酶、dNTPs、琼脂糖凝胶回收试剂盒等均购自上海生工公司。其他试剂均为分析纯或色谱纯。引物合成由上海生工公司完成。

1.2实验方法

1.2.1土壤中人参皂苷转化菌种的筛选称取5 g土样加入50 mL灭菌水，充分搅拌后静置，上清涂布于PDA固体培养基，28℃倒置培养72 h后，将平板上长出的菌落分别划线至新的PDA固体培养基上，28℃培养72 h。所得的真菌再经一次划线培养，得到9种形态不同的真菌，分别命名为J1~J9，4℃保存备用。

1.2.29种土壤真菌对人参皂苷的降解将分离得到的9种土壤真菌分别接种在V8汁液体培养基(1 L培养基含有 200 mL V8果汁上清、2 g CaCO3)中，28℃、150 r/min振荡培养72 h。加入灭菌的玻璃珠，200 r/min振荡10 min，用无菌纱布过滤，收集滤液，用25 mmol/L醋酸盐缓冲液(pH 5.0)稀释至孢子浓度为1.0×106个/mL。向上述菌液中加入底物人参皂苷Rb1(溶于ddH2O，用0.22 μm滤膜过滤除菌)，使其终浓度为0.5 mg/mL。28℃、150 r/min振荡培养。在不同的时间点取样，加入等量的正丁醇萃取，上层正丁醇相减压蒸干，重新溶于甲醇，用TLC法和HPLC法检测转化结果。

1.2.3真菌J7鉴定将待鉴定的真菌J7接种到 PDA固体培养基平板上，将灭菌的盖玻片斜插于平板上，于28℃恒温箱中暗培养。观察菌落的颜色和形态。待菌丝长到盖玻片上时，于显微镜下观察分生孢子梗、分生孢子及菌丝的大小和形态，并与《真菌鉴定手册》进行比对。

将真菌J7接种于V8汁液体培养基中，28℃、150 r/min振荡培养3 d。过滤收集菌丝体，液氮研磨，提取真菌J7的基因组DNA。采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增真菌J7的ITS片段。PCR扩增体系为：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs(10 μmol/L)0.5 μL，引物ITS1和ITS4(10 μmol/L)各0.5 μL，Taq酶0.2 μL，基因组DNA 0.5 μL，ddH2O补足体积至25 μL。扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 35 s，72℃ 1 min，循环35次；72℃ 8 min。PCR扩增结束后，用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，对产物进行切胶回收，送至上海生工生物技术公司进行测序。将序列上传至GenBank，并与11株真菌的ITS序列进行比对，应用MEGA 4.0软件构建系统发育树。

1.2.4黑曲霉J7发酵液中β-葡萄糖苷酶活性测定以对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物测定黑曲霉J7发酵液中β-葡萄糖苷酶活性，具体方法如下：取pNPG(5 mmol/L)30 μL、发酵液上清70 μL，用醋酸缓冲液(25 mmol/L，pH 5.0)补足体积至500 μL。反应混合物在37℃下避光反应30 min，然后加入2.5 mL NaOH(0.25 mol/L)终止反应。以无pNPG底物的反应体系作为对照，检测405 nm的吸光值。根据对硝基苯酚标准曲线计算发酵液中β-葡萄糖苷酶的酶活。以每分钟释放1 nmol对硝基苯酚所需要的酶量定义为1个酶活性单位。

1.2.5转化产物的检测与鉴定TLC检测：采用硅胶G60板。展开剂为氯仿：甲醇：水=65∶35∶10(V/V/V，下层)。显色剂：5%硫酸-乙醇溶液，105℃加热5 min显色。展开方式：上行展开。

HPLC检测：采用日本岛津HPLC系统，Shim-pack PREP-ODS (H)反相分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。以乙腈-水溶液进行如下程序的梯度洗脱：0~12 min，37.5%乙腈；12~32 min，37.5%~70%乙腈；32~42 min，70%乙腈；42~50 min，100%乙腈。流速：0.9 mL/min；柱温：30℃，检测波长：203 nm。

13C-NMR检测：采用Bruker Av-600 NMR核磁共振仪，氘代甲醇(MeOD)作为溶剂，四甲基硅烷(TMS)作为内标。

1.2.6黑曲霉J7转化人参皂苷Rb1制备C-K的条件优化对黑曲霉J7转化人参皂苷Rb1制备C-K的条件进行优化。转化pH分别选取4.0、5.0、6.0、7.0；反应温度为28℃、37℃、45℃；底物浓度为0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL。转化过程中定时取样，用等量正丁醇萃取，正丁醇相用TLC法和HPLC法检测转化效率，以0 h作为空白对照。

1.2.7转化体系的扩大将黑曲霉J7转化人参皂苷Rb1的体系放大至200 mL，在优化后的最适条件下进行反应：底物浓度：1 mg/mL；转化温度：28℃；转化pH 5.0。转化60 h后离心结束反应，收集上清用等量正丁醇萃取2次，合并正丁醇相50℃水浴蒸干后，复溶于甲醇中，TLC和HPLC分析转化结果。将样品冷冻干燥后，称重计算终产物C-K的收率。

2结果与分析

2.1菌种筛选与鉴定

从吉林省梨树县农耕土壤中分离纯化得到9株真菌，分别命名为J1~J9。对这9种真菌转化人参皂苷Rb1的能力进行了研究。结果表明除J6不转化外，其他8种真菌均能不同程度地转化人参皂苷Rb1。如表1所示，J2、J5、J8和J9能将底物人参皂苷Rb1转化为唯一产物Rd，Rd不能被继续水解。J1、J3、J4、J7能转化Rb1至稀有人参皂苷C-K。但J3和J4的转化途径更为复杂，产物C-K将会被进一步水解，造成C-K产率降低。而J1的转化效率较低。综合比较，J7能将人参皂苷Rb1转化为C-K，且转化途径清晰，转化效率高。因此，接下来对J7进行形态学和分子生物学鉴定，并对其水解人参皂苷Rb1的能力进行系统研究。

2.2真菌J7的鉴定

如图1所示，真菌J7的菌落形状为圆形或椭圆形，生长初期菌落呈白色，逐渐变成黄色最后为黑色，厚绒毛状；孢子为黑褐色，菌丝由白色变为浅黄色。倒置显微镜进行观察，发现菌株J7的菌丝较发达，壁厚、无隔、光滑；孢子为球形，壁光滑，呈褐色；顶部有球形顶囊，其上长有球状的分生孢子，呈黑褐色。通过比对《真菌鉴定手册》，菌株J7符合黑曲霉的形态学特征。将562 bp的ITS序列上传到NCBI中进行比对(GenBank登录号KF059971)，比对结果(图2)显示真菌J7与黑曲霉有着高度同源性。据此可以鉴定菌株J7为曲霉属(Aspergillus)黑曲霉菌，命名为黑曲霉Aspergillusnigersp. J7。

表1　9种土壤真菌对人参皂苷Rb1的转化

注： “+”检测表示有产物产生，“-”表示无产物产生。

图1　菌株J7的电镜形态图Fig.1　Microscopic images of strain J7.1：分生孢子梗和顶囊(10×10倍)；2：孢子(10×40倍)；3：菌丝(10×40倍)

图2　根据ITS序列绘制的黑曲霉J7进化树Fig.2　The phyligenetic tree of ITS sequence of A. niger sp. J7.

2.3黑曲霉J7转化人参皂苷Rb1的途径研究

对黑曲霉J7转化人参皂苷Rb1的能力进行了系统研究。TLC方法检测结果表明(图3)，在12 h内，底物Rb1出现了3个水解产物，其相对迁移率分别与人参皂苷标样Rd、F2、C-K一致。初步推测Rb1的水解途径为Rb1→Rd→F2→C-K。为验证这一结果，使用HPLC-C18反相柱层析对Rb1的转化过程进行检测。与标样(图4)相比，底物Rb1经黑曲霉J7水解后生成3种产物，分别与人参皂苷标样Rd、F2、C-K的保留时间一致(图5)。因此，确定Rb1的水解途径为Rb1→Rd→F2→C-K。由这一转化途径可知，黑曲霉对人参皂苷Rb1的C-3和C-20位糖基的水解能力不同。黑曲霉优先水解Rb1的C-20位外侧葡萄糖基，形成第一个中间产物Rd。接着，Rd的C-3位外侧葡萄糖基被切除，形成第二个中间产物F2。最后，F2 C-3位的内侧葡萄糖基被水解，形成终产物C-K。延长转化时间C-K也不能被继续水解，说明黑曲霉不能水解C-K的C-20位内侧葡萄糖基。

对终产物C-K的结构进行13C-NMR鉴定，结果如图6所示。在糖基异头碳存在的区域，只有唯一的化学位移δ98.62。与已有研究[14]对比，该位置为二醇型皂苷C-20位内侧的葡萄糖残基的异头碳(C-1)。因此，可以确定该产物为人参皂苷C-K。

图3　TLC分析黑曲霉J7转化人参皂苷Rb1过程Fig.3　TLC analysis of the biotransformation process of ginsenoside Rb1 by A. niger sp. J7.

图4　人参皂苷标准品的HPLC图谱Fig.4　HPLC analysis of the ginsenoside standard.注:Rb1、Rd、F2、C-K的保留时间分别为5.085 min、10.872 min、24.872 min和37.775 min

图5　HPLC分析黑曲霉J7对人参皂苷Rb1的转化过程Fig.5　HPLC analysis of the biotransformation process of ginsenoside Rb1 by A. niger sp.

图6　转化终产物C-K的13C-NMR图谱及结构Fig.6　13C-NMR spectrum and structure of transformed products C-K.

2.4转化条件优化

2.4.1最适发酵时间黑曲霉J7在V8汁液体培养基中，28℃、150 r/min条件下培养。分别测定不同时间点的发酵液中的β-葡萄糖苷酶酶活。由图7可知，黑曲霉J7在36~48 h时酶活快速增加，72 h时酶活达到最高值。继续培养酶活开始下降。因此确定最适发酵时间为72 h。

图7　黑曲霉J7发酵过程中胞外β-糖苷水解酶的酶活曲线Fig.7　The enzymatic activity of glycosidase from A. niger sp. J7.

2.4.2最适转化pH将72 h的菌液离心，收集菌丝体和孢子，用缓冲液制备成转化液，加入人参皂苷Rb1后，分别置于不同的条件下培养，HPLC法计算不同条件下的C-K产率，结果如图8A所示。pH 5.0时，12 h后黑曲霉J7可将人参皂苷Rb1完全转化成C-K，速度快且几乎没有中间副产物，当pH达到7.0时几乎没有C-K生成。因此最适转化pH确定为5.0。

2.4.3最适转化温度由图8B可知，在28℃时，黑曲霉J7可将人参皂苷Rb1完全转化成C-K，速度快且几乎没有中间副产物。37℃时C-K产率降低，45℃时几乎没有C-K生成。因此最适转化温度确定为28℃。

2.4.4最适底物浓度由图8C可知，将转化液中底物人参皂苷Rb1的浓度分别调节为0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL。结果表明，当浓度达到2 mg/mL时，24 h内Rb1不能实现完全转化，当浓度小于1 mg/mL时，12 h内Rb1即可完全转化为C-K，且没有其他产物生成。考虑到反应速率，因此最适底物浓度确定为1 mg/mL。

经过一系列单因素实验研究得出黑曲霉J7培养72 h后配制成的转化缓冲液转化人参皂苷Rb1最优条件如下：转化缓冲液pH 5.0，转化温度28℃，底物浓度1 mg/mL，在150 r/min条件下振荡培养12 h。

2.5转化体系的扩大

在最适条件下，将黑曲霉J7转化人参皂苷制

图8　黑曲霉J7转化人参皂苷Rb1制备C-K的条件优化Fig.8　Optimization of the conditions for preparation of C-K from ginsenoside Rb1 by A. niger sp. J7.A：不同pH下的C-K产率；B：不同转化温度下的C-K产率；C：不同底物Rb1浓度下的C-K产率

备C-K的体系放大至200 mL。60 h内黑曲霉J7可将200 mg人参皂苷Rb1全部转化为稀有人参皂苷C-K，转化率为74.7%。

3讨论

早先，研究者选用肠道菌群转化人参皂苷制备抗肿瘤活性分子C-K。但肠道菌是厌氧菌，培养困难且成本较高，不利于生物转化的放大，所以人们开始寻找其他适合的微生物来转化人参皂苷制备C-K。前期研究结果表明，曲霉属、根霉属、毛霉属、红曲霉菌属等霉菌具有降解人参皂苷的能力[20]，这些菌株被用于稀有人参皂苷C-K的转化制备。崔宇等[21]从人参种植土壤中筛选得到一株镰刀霉菌，利用该菌株转化人参果总皂苷以制备C-K，确定了该菌的最佳生长条件和最佳转化条件，为 C-K 的制备提供了一种可行的方法。侯耀达等[22]发现霉菌GS1-33能将人参根总皂苷转化为人参稀有皂苷C-K及Rh1，C-K的最大产率为14%，Rh1的最大产率为25%。由于这些研究多以混合皂苷作为底物，导致产物中除C-K外，还混有其他皂苷成分，给C-K的纯化带来困难。因此，筛选出成本低、安全性高、专一性好的转化菌株是目前制备人参皂苷 C-K 的首要任务。本研究从土壤中筛选到一株高效降解人参皂苷Rb1的黑曲霉，该菌向发酵液中分泌β-葡萄糖苷酶，能够高效转化人参皂苷Rb1生成稀有人参皂苷C-K。经过条件优化和转化体系扩大后，在60 h内，200 mg人参皂苷Rb1全部转化为单一产物，通过13C-NMR分析，确定终产物为稀有人参皂苷C-K。这说明黑曲霉J7分泌的胞外水解酶依次水解人参皂苷Rb1的C-20位外侧葡萄糖基、C-3位的外侧葡萄糖基和C-3位的内侧葡萄糖基，中间产物分别为人参皂苷Rd和F2，转化终产物为人参皂苷C-K。在这个过程中，黑曲霉J7不能进一步水解C-K中C-20位葡萄糖基而形成人参二醇型皂苷元，因此该菌的这一选择性使其适用于C-K的制备。这一转化过程中不涉及其余皂苷产物的生成，使产物C-K的纯化相对简便。此法适用于工业化制备，对稀有人参皂苷C-K的工业化制备具有重要意义。

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Enzymatic Degradation of Ginsenoside Rb1 for Preparation of Compound K byAspergillusnigersp. J7

GAO Juan1, ZHOU An-dong2, YUAN Ye1, ZHAO Tian-jiao1

1.SchoolofLifeSciences,NortheastNormalUniversity,Changchun130024,China;2.HighSchoolAttachedtoNortheastNormalUniversity,Changchun130024,China

Abstract:Minor ginsenoside Compound K (C-K) exhibited remarkable biological activities. In this study, nine fungi were isolated from soil, and their abilities of transform ginsenoside Rb1 for preparation of C-K were studied. A highly efficient ginsenoside Rb1-hydrolyzing fungus Aspergillus niger sp. J7 was screened. The strain converted ginsenoside Rb1 to C-K with the pathway of Rb1→Rd→F2→C-K. The conversion conditions of A. niger sp. J7 was optimized. Under the optimal conditions, ginsenoside Rb1 was converted to C-K completely. The transformation system was enlarged to 200 mL, in which ginsenoside Rb1 was completely converted into C-K after 60 h and the conversion rate was 74.7%. This fungus was expected to be the basis in bioactive C-K preparation.

Key words:ginsenoside; Aspergillus niger; biotransformation;β-glucosidase

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.02.04

作者简介：高娟，讲师，主要从事糖类化合物生物转化研究。E-mail：gaoj199@nenu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金(31400299)资助。

收稿日期：2015-12-15; 接受日期：2016-01-06