丙泊酚对脓毒症小鼠脾脏树突细胞亚群比例及IFN-γ、IL-10的影响

王桂岭　刘艳丽　刘　晓　刘庆阳　徐凯智

华北理工大学附属唐山工人医院　河北唐山　063000；①北京煤炭总医院



丙泊酚对脓毒症小鼠脾脏树突细胞亚群比例及IFN-γ、IL-10的影响

王桂岭刘艳丽刘晓刘庆阳①徐凯智

华北理工大学附属唐山工人医院河北唐山063000；①北京煤炭总医院

[摘要]①目的探讨丙泊酚对脓毒症小鼠脾脏树突细胞亚群比例及炎症细胞因子-γ(IFN-γ)、白细胞介素-10(IL-10)的影响。②方法采用盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)制作脓毒症模型，将60只C57BL/6小鼠随机分为假手术组(Sham组)、丙泊酚组(Propofol 5mg/kg，P组)和生理盐水组(normal saline，NS组)。模型制备成功后P组和NS组分别给予等量的1%丙泊酚和生理盐水腹腔内注射，分别在给药后0、6、12、24、36h眼球取血后颈椎离断法处死小鼠，无菌条件下取出小鼠脾脏，磁珠分选获得树突细胞(DC)，流式细胞仪检测树突细胞亚型比例改变，ELISA法检测各组小鼠血清中细胞因子IFN-r、IL-10水平。③结果与NS组比较，6h时P组R1经典树突细胞R1数量变化不显著，而在12h，P组的R1数量较NS组降低，在12、24、36h时调节性树突细胞R2数量显著增加；与此同时，细胞因子水平检测结果是：各时间点与Sham组相比，P组和NS组IFN-γ和IL-10水平均显著增加(P<0.05)；而与NS组相比，从6h开始P组各时间点的IFN-γ降低，IL-10水平升高(P<0.05)。④结论脓毒症早期细胞因子分泌均增加，丙泊酚在一定程度上可以通过增加R2比例及增加具有负向免疫调节细胞因子IL-10含量来抑制早期炎症反应，从而降低脓毒症小鼠体内炎症反应而影响预后。

[关键词]丙泊酚树突细胞免疫炎症细胞因子白介素

脓毒症是由感染因素诱发的全身性炎症反应综合征(SIRS)，是继发于严重烧烫伤、休克及大手术等的常见并发症，成为临床危重患者的主要死亡原因之一。尽管现代医学不断发展，但是脓毒症依旧是目前ICU病房面临的棘手问题。大量的研究显示，脓毒症的发生与免疫功能紊乱密切相关[1]。树突细胞(Dendritic Cell，DC)是唯一能激活初始T淋巴细胞的功能强大的专职抗原递呈细胞，同时也是机体免疫系统的重要调节细胞，在建立T细胞免疫应答和调节免疫反应中起到关键作用[2]。近年来, 有实验从白细胞介素(IL-10)转基因小鼠和正常BALB/c、C57BI/6小鼠的脾脏内分离出一个DC亚群CD11clowCD45RBhighDCs，该亚群与传统DC的区别主要是低表达CD11C和共刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子，高表达CD45RB，激活后主要通过分泌IL-10发挥负向免疫调节功能[3]。丙泊酚作为ICU危重患者的镇静治疗药物，近年来越来越受到重视，并且随着对丙泊酚研究的不断深入，发现其除了麻醉效应之外还存在一些其他效应，包括器官保护作用、免疫调节作用、抑制血小板聚集、抑制炎症反应和抗氧化作用等[4]。本研究拟从树突细胞亚群角度对比观察丙泊酚能促进早期脓毒症小鼠脾脏树突细胞向调节性树突细胞亚型分化，并能影响炎症细胞因子-γ(IFR-γ)、IL-10分泌从而验证其对脓毒症的免疫调节作用，为丙泊酚的进一步临床应用提供理论支持。

1实验动物与方法

1.1实验动物雄性清洁级BalB/c小鼠60只,体质量(20±1)g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司)，常规喂养，实验前12h禁食，自由饮水。

1.2试剂胶原酶D(美国Sigma公司)，小鼠淋巴细胞分离液(北京昊成天翔商贸有限公司)，RPMI 1640培养液与热灭活胎牛血清(北京思塞因科技有限公司)，DC阴选试剂盒(美国BD公司)，小鼠抗DC(CD11c微磁珠)，DC表面单克隆荧光抗体Fc阻断剂-纯化大鼠抗小鼠CD16/CD32(FcγIII/II-R)抗体、抗CD11c单克隆抗体-别藻蓝蛋白(CD11c-APC)、抗CD45RB单克隆抗体-藻红蛋白(CD45RB-PE)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗小鼠CD40、CD80、CD86、I-a/e(美国BD Biosciences Pharmingen公司)。

1.3实验方法

1.3.1实验分组。脓毒症模型制备及分组：将60只BalB/c小鼠适应性饲养1周后，按照随机数字表法将小鼠随机分为3组：Sham组、丙泊酚组(P组)和生理盐水组(NS组)。每组20只，其中P组和NS组按盲肠结扎穿孔法(Cecal ligation puncture， CLP)制备脓毒症模型，Sham 组仅开腹翻动盲肠。术后禁食12h，自由饮水。造模成功，NS组和丙泊酚组分别给予等量的生理盐水和丙泊酚(5mg/mL)腹腔注射,Sham组不作任何处理。所有动物按0、6、12、24、36h被评价，每个时间点为4只小鼠。

1.3.2标本采集与处理。分别在每个时间点摘除眼球取血0.5～1.0mL，离心后留血清-20℃下保存待测。之后，固定小鼠于仰卧位，沿腹中线依次切开皮肤、腹壁各层进入腹腔，暴露脾脏，钝性取去被膜脾脏，置入盛有PBS液的平皿中用于提取树突状细胞。

1.3.3小鼠脾细胞的分离及单个核细胞的制备。留取脾脏，剪碎组织，用研磨棒于220目金属网上研磨。将细胞悬液贴15mL离心管壁小心加入到小鼠淋巴细胞分离液上，20℃、1500r/min离心15min，吸取中层絮状物，置于离心管中，加4倍D-PBS缓冲液重悬，4℃、1000r/min离心10min，去除多余的淋巴细胞分离液，所得细胞即为小鼠脾脏单个核细胞。

1.3.4磁珠孵育和磁性分选脾脏CD11clowCD45RBhighDCs。使用DCs阴选试剂盒分选获得DCs，具体操作严格按说明书进行。富集的小鼠脾脏DCs不含抗体及磁珠，细胞计数后用于后续实验。CD11clowCD45RBhighDCs的纯化通过抗CD11c磁珠选出。

1.3.5荧光抗体染色。将4中的CD11clowCD45RBhighDCs孵育24h，连同孵育液一并加入流式管，离心，吸取上清，-70℃保存。加入100μL PBS重悬离心后沉淀的细胞，调整细胞密度为2×105个/mL，加入Fc阻断剂1μL，4℃孵育15min；分别加入5μL CD11c-APC、CD45RB-PE、CD40-FITC、CD80-FITC、CD86-FITC、I-a/e-FITC，避光孵育15min；加入2mL PBS洗涤1次，离心后去上清，加入0.4mL PBS，采用流式细胞仪检测相关标记物。

图1小鼠脾脏DCs经CD11c及CD45RB抗体染色的细胞亚群流式细胞图，PE代表前向角，APC代表侧向角，R1表示CD11chighCD45RBlowDCs，R2表示CD11clowCD45RBhighDCs。

1.3.6血清中细胞因子水平的检测。所有全血立即37℃恒温孵育15min，离心(3000rpm)10min，分离血清，按照 ELISA 试剂盒说明书检测 IL-10及IFN-γ的表达水平，每组设3复孔。

2结果

2.1小鼠脾脏DC分离与亚群鉴定用标染的CD11c-APC和CD45RB-PE对分选所得的DC同时进行染色，染色满意后采用流式细胞仪进行分析，结果显示所得DC分为3群，即CD11clowCD45RBhighDC、CD11chighCD45RBlowDC和CD11clowCD45RBlowDC。采用磁珠分选技术获取CD11clowCD45RBhighDC，流式细胞术检测存活率>90%，见图1。

2.2丙泊酚刺激后小鼠脾脏中DCs亚群分化的比例变化与 NS组比较，6h时丙泊酚处理组R1数量变化不显著，R2数量显著增加，而在12h，丙泊酚处理组的R1数量较NS组降低，在12、24、36h时，R2数量显著增加，见表1。

表1　丙泊酚组与NS组不同时间点小鼠脾脏DCs亚群比例±s,n=4只)

注：与NS组相比,*P<0.05

2.3丙泊酚刺激后脓毒症小鼠血清中细胞因子的变化脓毒症小鼠血清中IL-10、IFN-γ水平较SHam组小鼠明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；经过丙泊酚的刺激后，P组血清中INF-γ水平较NS组小鼠明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，IL-10水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、表3。

表2　3组不同时间点血清中IL-10水平的比较只)

注：与Sham组相比；*P<0.05；与NS组相比较，#P<0.05

表3　3组不同时间点血清中IFN-γ水平比较只)

注：与Sham组相比较；*P<0.05，与NS组相比较，#P<0.05

3讨论

脓毒症是病原微生物与机体免疫系统炎症反应间相互作用，造成机体多器官功能损害的临床综合征，是一种高致病性疾病，每年夺走数以万计患者的生命,是危重病医学关注的热点和难点问题[5]。脓毒症时细胞因子的释放呈级联“瀑布”效应，形成复杂的调节网络，释放大量的炎症因子，除了促炎症细胞因子之外还有下调炎症反应的抗炎细胞因子如IL-10等[6]。促炎和抗炎细胞因子二者相互制约，影响脓毒症时全身炎症反应综合征(SIRS)的发展。当机体遇到应激源刺激后，IFN-γ和TNF-α是应激反应产生早期的和核心作用的炎症介质，具有早期合成释放的特点[7]。IL-10是内源性抗炎介质，可由促炎因子和内毒素诱导产生，能抑制免疫应答，抑制巨噬细胞抗原呈递，抑制多基因转录，从而抑制多种炎症细胞的分泌功能及炎症因子的生成，对LPS诱导的促炎症介质的释放有明显的抑制作用[8]。

脓毒症死亡患者的尸检显示，细胞凋亡在脓毒症的发病中具有十分重要的作用，大量淋巴细胞凋亡是机体发生免疫抑制的重要原因之一[9]。最新的研究显示，在脓毒症中除了大量淋巴细胞凋亡之外，DC细胞的凋亡和亚群及表面分子改变也占有重要地位[10]。丙泊酚目前广泛应用于ICU脓毒症、严重创伤等危重患者的镇静治疗，国内外学者已经研究证实丙泊酚具有抗炎抗氧化作用[11]。Aniguchi等[12]发现丙泊酚可抑制内毒素所致的促炎性细胞因子的产生，并能减轻中性粒细胞的浸润。目前，丙泊酚对不同树突细胞亚群免疫功能的影响及具体调节机制并不是十分清楚，查阅文献发现国内外有关丙泊酚与树突细胞二者关系的研究甚少，为探讨丙泊酚与树突细胞二者之间是否有关联特进行本次实验。

本实验结果表明，无论是腹腔注射生理盐水还是注射丙泊酚，两组的IL-10和IFN-γ水平都是升高的，说明此时小鼠体内正处于促炎反应与抑炎反应的失衡状态；而与NS组相比，P组的IL-10升高相对于IFN-γ的降低占据绝对优势。丙泊酚能抑制脓毒症早期促炎因子IFN-γ等的分泌，同时增加IL-10的分泌，可减少组织炎症损伤，保护机体器官功能。同时CD11clowCD45RBhighDC的比例升高，由此可以看出丙泊酚既可以促进CD11clowCD45RBhighDC的活化，同时能促进IL-10的分泌，而树突细胞亚型-CD11clowCD45RBhighDC以分泌IL-10为主，由此可以推断丙泊酚介导机体的免疫抑制活性可能是通过刺激CD11clowCD45RBhighDC活化增加抑制因子IL-10分泌来发挥作用，为其应用于损伤早期控制过度炎症反应提供理论依据。但是由于实验局限性，本实验并未涉及浓度梯度的丙泊酚对小鼠CD11clowCD45RBhighDC不同比例的探讨，因此二者之间的剂量效应关系有待进一步实验研究。

参考文献

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(岳静玲编辑)

Effect of propofol on splenic dendritic cells and level of IFN-r、IL-10 in septic mice

WANGGuiling,LIUYanli,LIUXiao,et

al(AnesthesiologyDepartment,AffiliatedWorkersHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the effect of propofol on splenic dendritic cells and the level of IFN-r、IL-10 in septic mice.MethodsSesis models were made by cecal ligation and puncture(CLP) in C57BL/6 mice.Sixty mice were divided into three groups as follows:Sham group,NS group and Propofol (5mg/kg) treatment group.After model making successfully,the NS group was given 0.9% saline and the propofol group was given equal amount of propofol intraperitoneal injection respectively.Then,the mice were sacrificed after the 0,6,12,24 and 36 hours respectively,with four animals at each time point.DCs were isolated by Magnetic microbeads from mice.The phenotypes of cells were analyzed with flow cytometry,and the cytokine levels of IL-10 and IFN-r were measured by ELISA.ResultsCompared with the results of the NS group, the proportion of R2(regulatory DC cells) in Propofol group significantly increased at 12,24 and 36 hour point(P<0.05).Compared with the results of the sham group,the level of IL-10 and IFN-r in NS group and Propofol group both increase markedly(P<0.05).In addition,compared with the results of the NS group,the level of IL-10 increases largely and the level of IFN-r decreases significantly(P<0.05).ConclusionThe level of IFN-r and Il-10 both increase in early sepsis.To a certain extent,propofol could inhibit the early inflammatory response by altering the release of inflammatory factor and increasing the proportion of regulatory DCs to reduce inflammation and improve the prognosis of sepsis.

[KEYWORDS]Propofol.Dendritic cells.Regulatory dendritic cells.Immunity

[中图分类号]R 614.1 R392.5

[文献标识码]A

[文章编号]2095-2694(2016)02-88-04

【通讯作者】徐凯智。

【作者简介】王桂岭(1987-)，女，硕士研究生,住院医师。研究方向：脓毒症免疫与器官保护。