双酚A暴露对iNOS基因缺失实验鼠生殖能力的影响

张金文，杜春海,张　杰(.河北医科大学第二医院血管外科，河北 石家庄 050000；.河北省景县人民医院外科，河北 景县 05500；.河北医科大学第四医院妇瘤科，河北 石家庄 0500)



·论著·

双酚A暴露对iNOS基因缺失实验鼠生殖能力的影响

张金文1，杜春海2,张杰3(1.河北医科大学第二医院血管外科，河北 石家庄 050000；2.河北省景县人民医院外科，河北 景县 053500；3.河北医科大学第四医院妇瘤科，河北 石家庄 050011)

[摘要]目的研究双酚A(bisphenol A，BPA)对诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS )基因缺失实验鼠(iNOS(-/-))生殖能力的影响。方法选取基因型实验鼠(iNOS(+/+))和iNOS(-/-)实验鼠分别配对，计算每窝子鼠的数量及性别比例，然后选取幼鼠强饲(oral gavage) BPA 100和200 μg·kg(-1)·d(-1),共13 d，统计实验鼠的排卵数量。结果2种实验鼠生产仔鼠数量和仔鼠雌雄比例差异无统计学意义，iNOS(-/-)对照组和iNOS(+/+) 200 μg·kg(-1)·d(-1)实验组卵细胞数高于iNOS(+/+) 100 μg·kg(-1)·d(-1)实验组(P<0.05)；iNOS(-/-)实验鼠200 μg·kg(-1)·d(-1)实验组排卵细胞数量明显少于其他5组(P<0.05)。结论iNOS基因缺失未导致小鼠生育能力和子鼠雌雄比例的明显异常；BPA暴露导致iNOS(+/+)和iNOS(-/-)实验鼠排卵数量下降，提示iNOS具有保护雌鼠在卵细胞成熟及排卵免受BPA负面的影响。

[关键词]一氧化氮合酶；双酚A；生育力；小鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.022

诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)催化左旋精氨酸(L-arginine)产生一氧化氮(nitric oxide，NO)，作为一个重大的旁分泌调解器和生理调节剂在雌性生殖系统发育过程和卵细胞发育成熟中起到重要的调节作用[1-4]。人类通过接触含双酚A(bisphenol A，BPA)日用品而受到影响。BPA暴露可引起减数分裂的异常[5]或干扰卵母细胞第二次减数分裂中纺锤体的形成，导致卵子的非整倍体[6]。在人类的卵泡液和羊水中可检测到BPA[7-8]。BPA阻止卵细胞成熟﹑干扰囊胚形成、降低生育能力并导致复发性自然流产[9]。本研究采用BPA对iNOS-/-实验鼠和iNOS+/+实验鼠管饲，旨在观察iNOS基因和BPA对实验鼠卵细胞发育成熟能力的影响。报告如下。

1材料与方法

1.1实验动物选取iNOS-/-(美国)和iNOS+/+(德国 )实验鼠，来自同窝出生仔鼠，实验鼠按标准进行饲养[10]。iNOS-/-、iNOS+/+出生后20～22 d健康的雌鼠和雄鼠分别被关在一个标准的动物设施内，控制温度(22°C)、光周期(12 h光照,12 h黑暗)，能够自由获得水和饲料。本研究经当地动物伦理委员会批准。

1.2iNOS-/-和iNOS+/+实验鼠生殖能力及仔鼠雌雄比例观察出生后20～22 d iNOS-/-实验鼠和iNOS+/+实验鼠，分别选取一雌和一雄进行配对交配，每组54对，于出生后1周统计产生仔鼠只数，并根据外生殖器形态计数雌雄比例。

1.3BPA管饲法BPA(CAS-Nr:80-05-7, Merck)溶于2 g/L乙醇中，然后用玉米油稀释到0.01 g/L。乙醇在玉米油中的浓度是0.5%。雌性幼体 (生后20～22 d)的iNOS-/-和iNOS+/+实验鼠用管饲法灌注BPA 100和200 μg·kg-1·d-1，另每组设对照组管饲法灌注0.5%乙醇(玉米油稀释)。

1.4卵母细胞收集雌性实验鼠在BPA(实验组)和溶剂组(对照组)管饲第11天肌内注射5 U孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMS, Sigma-Aldrich，USA)， 42～44 h后晚间肌内注射5 U孕马绒毛膜促性腺激素释放激素(Sigma-Aldrich，USA)。15 h后从输卵管收集已排出的卵细胞。收集每个实验组的卵丘复合体，卵母细胞周围的其他组织用透明质酸酶去除(Sigma-Aldrich,USA. 400～1 000 units/mg)并计算卵细胞个数及每组老鼠卵细胞的平均排卵率。

1.5统计学方法应用 SPSS 13.0统计学软件包进行数据分析。计量资料比较分别采用t检验、F检验和q检验；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1iNOS-/-和iNOS+/+实验鼠仔鼠数量及仔鼠雌雄比例比较iNOS-/-和iNOS+/+组实验鼠生产仔鼠数量和仔鼠雌雄比例差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　iNOS-/-和iNOS+/+实验鼠仔鼠数量及

2.2BPA对iNOS-/-和iNOS+/+实验鼠卵细胞产生量的影响iNOS-/-对照组和iNOS+/+200 μg·kg-1·d-1实验组卵细胞数高于iNOS+/+100 μg·kg-1·d-1实验组(P<0.05)；iNOS-/-实验鼠200 μg·kg-1·d-1实验组排卵细胞数量明显少于其他5组(P<0.05)。见表2。

表2　BPA对iNOS-/-和iNOS+/+实验鼠

*P<0.05与iNOS+/+对照组比较#P<0.05与iNOS+/+100 μg·kg-1·d-1比较△P<0.05与iNOS+/+200 μg·kg-1·d-1比较☆P<0.05与iNOS-/-对照组比较▲P<0.05与iNOS-/-100 μg·kg-1·d-1比较(q检验)

3讨论

BPA的化学名为2，2-二(4-羟基苯基) 丙烷，简称二酚基丙烷，是一种酚类环境雌激素，在工业上又叫作聚碳酸酯，它是世界上使用最广泛的工业化合物之一，主要用于生产聚苯醚树脂、环氧树脂、聚酯树脂、不饱和聚砜树脂等多种高分子材料。矿泉水瓶、婴儿用瓶、罐头内包装、食品包装内里、医疗器械、牙科填充剂以及其他数百种日用品中都含有BPA。2003～2004年，美国健康和营养调查协会对6岁以上不同性别和年龄的2 517例调查者进行了尿样检测，其结果发现在92%以上调查者尿样中检测到BPA[11]。

BPA 是由2个不饱和酚环组成的联苯复合物，包含2个处在对位的羟基，结构类似于雌二醇(estradiol，E2)和己烯雌酚( diethylstilbestrol，DES)。BPA单体分子之间会发生聚合，以酯键结合在一起，当这些聚合物在高温下或与碱性/酸性物质放在一起时，就会破坏BPA 分子之间的酯键，使之发生断裂，游离出BPA 分子的单体。由于BPA 的结构与E2和DES类似，因此它具有弱的雌激素活性，它可干扰机体的内分泌系统。

Hunt等[5]给青春期雌性小鼠按体质量喂服20、40、100 μg·kg-1·d-1BPA共7 d，发现在卵母细胞生长的最后阶段，短期、低剂量BPA暴露，导致卵母细胞减数分裂发生异常。BPA作为一个强有力的非整倍体诱发剂作用于哺乳动物的卵母细胞，诱导染色体分离发生错误；BPA也能干扰卵母细胞第2次减数分裂中纺锤体的形成，导致卵子的非整倍体[9，11]。BPA暴露也会影响原始卵泡的启动募集。Rivera等[12]将出生后1～14 d的雌性羔羊进行低剂量BPA 处理，结果发现BPA 刺激了原始卵泡的启动募集，使卵巢中原始卵泡的数量显著减少，增加了有腔卵泡的发育数量，提高了有腔卵泡的闭锁率。BPA引起的卵泡发育进程的改变，将会影响羔羊成年后的卵巢功能。Chao等[7]对新生鼠用BPA 处理，促进了原始卵泡向初级卵泡的转变，使得原始卵泡库中原始卵泡的数量显著减少，严重影响了成年鼠的生育能力，并发现BPA能增强卵巢雌激素受体(estrogen receptor，ER)在mRNA和蛋白水平的活性，干扰减数分裂Ⅰ期纺锤体准确的组装，导致 CD-1实验鼠卵细胞发育成熟受阻。

人类BPA暴露可能与女童性早熟发病有关[13]。BPA 暴露可能是影响职业女性血清催乳素水平的独立危险因素[14]。Machtinger等[8]发现在体外BPA能干扰人卵细胞的成熟，破坏卵细胞纺锤体构成及染色体在卵细胞赤道板上的排列，导致卵细胞染色体畸形发生。

本研究结果发现，BPA暴露100 μg·kg-1·d-1可减少 iNOS-/-和iNOS+/+实验鼠排卵细胞的数量；在BPA暴露200 μg·kg-1·d-1剂量， iNOS-/-200 μg·kg-1·d-1组较iNOS-/-100 μg·kg-1·d-1组和iNOS+/+两实验组实验鼠排卵细胞的数量的减少差异有统计学意义。

iNOS诱导产生的NO在雌性生殖系统具有促进卵泡形成、排卵、受精卵着床及孕期维护的作用[4]。采用抑制NO合成的措施可以影响猪的排卵[1]。内皮型一氧化氮合酶基因敲除小鼠的性周期紊乱，其排卵率、卵巢形态学和类固醇生成也受到干扰[15]。本研究结果显示，iNOS基因敲除实验鼠的繁殖能力和仔鼠雌雄比例差异均无统计学意义。该结果与Huo等[16]报道的iNOS-/-实验鼠没有明显的的生育表型结果相一致。提示iNOS催化合成的NO不能直接或间接地控制卵细胞的基因表达，或iNOS基因敲除被复杂基因调控与补偿有关。

已证实BPA暴露导致小鼠染色体联会异常[17]，干扰人类染色体准确分离和DNA的修复[18]。 Hunt等[5]发现BPA暴露青春期雌性小鼠明显增加卵子的非整倍体。本研究BPA 100 μg/kg的暴露可使iNOS+/+实验鼠和iNOS-/-实验鼠得到的排卵母细胞减少，但是卵细胞减少的数量与各自的对照组获得卵细胞数量比较差异无统计学意义，与相关报道iNOS-/-实验鼠的排卵未受影响相似[19-20]。本研究只有BPA 200 μg·kg-1·d-1的iNOS-/-实验鼠的排卵数量明显减少，表明iNOS可能保护雌鼠在卵细胞成熟以及排卵免受BPA负面的影响。

本研究结果显示， iNOS-/-和iNOS+/+组每窝仔鼠数量和雌雄比例水平差异均无统计学意义；但是BPA暴露能导致实验鼠排卵量下降，并且iNOS-/-组排卵量明显低于iNOS+/+组。提示可能与iNOS基因缺失致使蛋白PLK1和蛋白RAN低表达及染色体集合失败有关[21]。

总之，BPA暴露可导致小鼠排卵数量下降，并且iNOS基因缺失致使排卵下降更明显。所以，杜绝人类使用含有BPA的日用品，对保护女性卵细胞正常发育和减少胚胎发育畸形具有重要意义；同时也可利用基因敲出技术，研究不同基因和不同环境因素影响下对哺乳类动物卵细胞成熟发育影响过程中的具体机制。

[参考文献]

[1]Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition[J]. Biochem J，2001，357(Pt 3):593-615.

[2]Schwarz KR,Pires PR,de Bem TH,et al. Consequences of nitric oxide synthase inhibition during bovine oocyte maturation on meiosis and embryo development[J]. Reprod Domest Anim,2010,45(1):75-80.

[3]Jablonka-Shariff A, Ravi S,Beltsos AN,et al. Abnormal estrous cyclicity after disruption of endothelial and inducible nitric oxide synthesis in mice[J]. Biol Reprod,1999,61(1):171-177.

[5]Hunt PA，Koehler KE，Susiarjo M，et al. Bisphenol a exposure causes meiotic aneuploidy in the female mouse [J]. Curr Biol，2003，13(7)：546-553.

[7]Chao HH, Zhang XF, Chen B, et al. Bisphenol A exposure modifies methylation of imprinted genes in mouse oocytes via the estrogen receptor signaling pathway[J]. Histochem Cell Biol,2012，137(2):249-259.

[8]Machtinger R, Combelles CM, Missmer SA, et al. Bisphenol A and human oocyte maturation in vitro[J]. Hum Reprod,2013,28(10):2735-2745.

[9]Ehrlich S, Williams PL, Missmer SA,et al. Urinary bisphenol A concentrations and early reproductive health outcomes among women undergoing IVF[J]. Hum Reprod,2012,27(12):3583-3592.

[10]张金文，杜春海.染色体C带荧光染色鉴定实验鼠卵细胞非整倍体[J].国际生殖健康/计划生育杂志，2014,33(4)：271-273.

[11]Varayoud J，Ramos JG，Bosquiazzo VL，et al. Developmental exposure to bisphenol a impairs the uterine response to ovarian steroids in the adult[J]. Endocrinology，2008，149(11):5848-5860.

[12]Rivera OE，Varayoud J，Rodríguez HA，et al.Neonatal exposure to bisphenol A or diethylstilbestrol alters the ovarian follicular dynamics in the lamb[J]. Reprod Toxicol，2011，32(3):304-312.

[13]陈瑶，黄红，沈理笑,等.尿液双酚A浓度及生活习惯与女童性早熟关系的研究[J].中国儿童保健杂志，2013,21(3):237-240.

[14]郝俊霞，王金桃， 赵维敏,等. 双酚A 暴露对职业女工性激素的影响[J].卫生研究,2011,40(3):312-314,319.

[15]Mitsube K, Mikuni M, Matousek M, et al. Effects of a nitric oxide donor and nitric oxide synthase inhibitors on luteinizing hormone-induced ovulation in the ex-vivo perfused rat ovary[J]. Hum Reprod,1999,14(10):2537-2543.

[16]Huo LJ, Liang CG, Yu LZ, et al. Inducible nitric oxide synthase-derived nitric oxide regulates germinal vesicle breakdown and first polar body emission in the mouse oocyte[J]. Reproduction,2005,129(4):403-409.

[17]Susiarjo M,Hassold TJ,Freeman E,et al. Bisphenol A exposure in utero disrupts early oogenesis in the mouse[J]. PLoS Genet,2007,3(1):e5.

[19]Jablonka-Shariff A, Basuray R, Olson LM.Inhibitors of nitric oxide synthase influence oocyte maturation in rats[J]. J Soc Gynecol Investig,1999,6(2):95-101.

[20]Hefler LA,Gregg AR. Inducible and endothelial nitric oxide synthase:genetic background affects ovulation in mice[J]. Fertil Steril,2002,77(1):147-151.

[21]张金文，杜春海. 张杰.双酚A对诱导型一氧化氮合酶基因缺失鼠卵细胞染色体不分离的影响[J].国际生殖健康/计划生育杂志，2015,34(3)：184-188.

(本文编辑：赵丽洁)

[中图分类号]R339.221

[文献标志码]B

[文章编号]1007-3205(2016)03-0328-04

[作者简介]张金文(1960-)，男，河北景县人，河北医科大学第二医院副主任医师，医学博士，从事血管外科疾病诊治研究。

[收稿日期]2015-11-18；[修回日期]2015-12-16