孕妇血浆中胎儿特异性C21orf105、PLAC4 mRNA的检测*

许雅娟，张莹莹，罗晓华，翟闪闪，冉利敏，任利单，洪　腾

郑州大学第三附属医院产科 郑州 450052

△女，1963年4月生，本科，主任医师，研究方向：围产医学，E-mail：cnzzzsl@163.com



孕妇血浆中胎儿特异性C21orf105、PLAC4 mRNA的检测*

许雅娟△，张莹莹，罗晓华，翟闪闪，冉利敏，任利单，洪腾

郑州大学第三附属医院产科 郑州 450052

△女，1963年4月生，本科，主任医师，研究方向：围产医学，E-mail：cnzzzsl@163.com

关键词21-三体综合征；C21orf105；PLAC4;血浆

摘要目的：探讨孕妇血浆中胎儿特异性C21orf105、PLAC4 mRNA的稳定性及其表达量检测的临床价值。方法：①收集30例健康单胎妊娠妇女的血样，分为8组，其中4组分别在室温中放置0、6、24、72 h，余4组分别于4 ℃条件下放置0、6、24、72 h，然后采用实时荧光定量RT-PCR法检测C21orf105、PLAC4 mRNA。②收集健康单胎妊娠妇女的血样，其中经染色体核型分析证实胎儿为21-三体综合征的孕妇38例，胎儿染色体正常的孕妇40例，同法检测血浆C21orf105、PLAC4 mRNA。结果：30例孕妇血浆中均能检测到C21orf105、PLAC4 mRNA，孕妇血浆室温放置72 h后，C21orf105、PLAC4 mRNA无明显降解(P>0.05)。21-三体综合征胎儿孕妇血浆中C21orf105、PLACA4 mRNA表达量高于正常胎儿孕妇(P<0.001)。结论：母体血浆中C21orf105、PLAC4 mRNA很稳定，其检测有望成为21-三体综合征产前筛查的有效指标。

Plasma levels of fetal-specific C21orf105 and PLAC4 mRNA of pregnant women with trisomy 21 syndrome fetus

XUYajuan，ZHANGYingying，LUOXiaohua，ZHAIShanshan，RANLimin，RENLidan，HONGTeng

DepartmentofObstetrics,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordstrisomy 21 syndrome;C21orf105;PLAC4;plasma

AbstractAim: To explore the stability of the fetal-specific C21orf105 and PLAC4 mRNA and their expressions in the maternal plasma of pregnant women with trisomy 21 syndrome fetus.Methods: The plasma of 30 healthy and singleton pregnant women were collected and allocated in 8 groups, 4 groups were stored for 0,6,24 and 72 h at 4 ℃, and the other 4 groups were stored for 0,6,24 and 72 h at room temperature,respectively, then the expressions of C21orf105 and PLAC4 mRNA were detected using real-time RT-PCR.A total of 40 blood samples from normal pregnant women and 38 samples from trisomy 21 syndrome fetus pregnant women were collected to detect C21orf105 and PLAC4 mRNA in maternal plasma.Results: C21orf105 and PLAC4 mRNA could be detected in all the maternal plasma samples, even in maternal plasma samples stored at room temperature for 72 h, and there was no significant differences among the 8 groups(P>0.05).The mRNA expression levels of C21orf105 and PLAC4 in maternal plasma of the trisomy 21 syndrome pregnant women were higher than those of the normal controls(P<0.001).Conclusion: C21orf105 and PLAC4 mRNA in maternal plasma is stable enough to be amplified,and they are potential markers for prenatal screening of trisomy 21 syndrome.

21-三体综合征是人类最常见的染色体疾病，发生率约1/800，绝大多数患者表现为严重智力障碍及多种脏器的异常[1]。染色体核型分析是检测胎儿21-三体综合征的金标准[2]，但其为侵入性操作，且操作复杂,花费时间较长，费用高，难以被孕妇接受,因此亟需一种能够在孕早期实施且安全、简便、敏感性和特异性均较高的非侵入性产前筛查与诊断方法。母血中胎儿游离mRNA的发现为胎儿染色体非整倍体疾病的非侵入性产前筛查开辟了新的方向[3]。C21orf105[4]和PLAC4[5]mRNA位于21号染色体唐氏综合征关键区，具有胎儿特异性、妊娠特异性，孕早期即可在孕妇血浆中检测到，产后迅速消失。目前孕妇血浆中C21orf105和PLAC4 mRNA表达与胎儿21-三体综合征之间的关系尚存有争议[6-8]，且对于离体血标本的存放温度及处理时间也无统一标准。该研究旨在探讨采用实时荧光定量RT-PCR法定量分析孕妇外周血中C21orf105、PLAC4 mRNA的方法稳定性及其在胎儿21-三体综合征产前筛查方面的价值。

1材料与方法

1.1标本来源①选取2014年6月至9月在该院门诊行围产保健的健康单胎妊娠妇女30例,均为初产妇，年龄(27.6±5.2)岁；抽取其外周血15 mL，分为8组(A0、A1、A2、A3组和B0、B1、B2、B3组)，用于孕妇外周血中C21orf105、PLAC4 mRNA稳定性的研究。 ②2013年7月至2014年9月郑州大学第三附属医院共行羊水穿刺及染色体核型分析2 100例。选择门诊行围产保健的身体健康且均为单胎妊娠、经染色体核型分析证实胎儿为21-三体综合征的孕妇38例作为病例组，胎儿染色体正常的孕妇40例作为对照组。该两组孕妇血浆标本用于C21orf105、PLAC4 mRNA表达与胎儿21-三体综合征关系的研究。

1.2母体血浆中C21orf105、PLAC4 mRNA的检测

1.2.1标本处理对血标本进行“二步离心”处理[9]。4 ℃条件下1 600× g低速离心10 min，将上清液移入新的无RNase的EP管中；在4 ℃条件下16 000 g高速离心10 min，将上清液移入无RNase的EP管中；加入TRI 试剂(MRC公司)，于-80 ℃条件下保存。用于mRNA稳定性研究的标本经“二步离心”后， A0、A1、A2、A3组于室温中分别放置0、6、24、72 h后加入TRI试剂，B0、B1、B2、B3组于4 ℃条件下分别放置0、6、24、72 h后加入TRI 试剂，剧烈振荡后于-80 ℃保存。

1.2.2血浆总RNA的提取及反转录血浆总RNA的提取使用美国MRC公司的TRI试剂，具体步骤按说明书操作，分光光度仪检测RNA浓度和纯度后，立即进行反转录。使用日本TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover试剂盒，总反应体系为20 μL：12 μL RNA于65 ℃条件下热变性5 min后，立即置于冰上，加入4 μL 4×DN Master Mix(已添加gDNA Remover)，置于37 ℃条件下5 min，加入 4 μL 5×RT Master Mix Ⅱ，37 ℃ 15 min，50 ℃ 5 min，98 ℃ 5 min，反应结束后，产物于-20 ℃保存。上述反应液均在冰上配置。如无特殊说明，离心条件均为4 ℃ 16 000× g离心10 min。

1.2.3实时荧光定量PCR在NCBI数据库检索C21orf105和PLAC4序列, 使用软件Primer Express 2.0 设计PCR引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表1。采用康为世纪公司的UltraSYBR Mixture(With ROX)试剂盒进行实时荧光定量PCR，以β-actin作为内参基因。总反应体系包括2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环;于60 ℃收集荧光信号。每个标本重复3次。仪器为美国ABI 7500 real-time PCR System。采用2-ΔΔCt法计算最终结果。

表1　PCR引物序列

1.3统计学处理采用SPSS 17.0进行统计分析，采用析因设计的方差分析来评判血样存放时间和温度对C21orf105、PLAC4 mRNA测定结果的影响；病例组和对照组孕妇血浆中两种mRNA表达量的比较采用两独立样本t检验；检验水准α=0.05。

2结果

2.1实验质量评估各组PCR产物的溶解曲线均为单峰，无非特异性扩增等情况。孕妇血浆中均能检测到C21orf105、PLAC4 mRNA和β-actin mRNA，检出率为100%。

2.2孕妇血浆中C21orf105、PLAC4 mRNA的稳定性以A3、B3组为例，扩增曲线见图2。8组C21orf105、PLAC4 mRNA检测结果见表2、表3。标本存放温度和时间对血浆中C21orf105、PLAC4mRNA的测定无显著影响，孕妇血浆中C21orf105、PLAC4 mRNA稳定性较好。

从上到下依次为C21orf105、A3组PLAC4、B3组C21orf105、B3组PLAC4。图2　A3及B3组的扩增曲线

t(处理)/hT(存放)室温4℃00.044±0.0490.044±0.04960.031±0.0280.041±0.018240.045±0.0280.034±0.006720.047±0.0510.048±0.022

Ft=2.608,P=0.052；FT=0.417,P=0.519；F交互=0.244,P=0.866。

表3　孕妇血浆中PLAC4 mRNA检测结果(n=3)

Ft=1.555,P=0.201；FT=0.408,P=0.524；F交互=0.668,P=0.573。

2.3病例组和对照组孕妇血浆中C21orf105、PLAC4 mRNA表达量的比较两组孕妇的年龄、孕龄、孕次差异无统计学意义(表4)，具有可比性。病例组孕妇血浆中C21orf105、PLAC4 mRNA表达量均高于对照组，见表5。

表4　两组孕妇一般情况比较

表5　两组孕妇血浆中

3讨论

目前，胎儿染色体疾病的产前筛查方法有超声学检查及血清学筛查，但均存在敏感性和特异性低的问题，而无创产前DNA筛查技术费用较高，不适于普遍筛查。胎儿C21orf105[4]和PLAC4[5]基因均位于21号染色体上，孕早期孕妇血浆中即能检测到C21orf105和PLAC4 mRNA，而非妊娠妇女血浆中检测不到，故二者有望用于21-三体综合征的无创产前筛查。

对于离体血标本的存放温度和处理时间，目前报道尚不统一，有将外周血标本离体后置于室温下3 h[10]、6 h[11]、24 h[12]内处理；也有将血标本存放于4 ℃条件下72 h[4]内处理；Ng等[12]研究发现孕妇外周血离体后室温放置24 h，hPL、hCG mRNA浓度无明显改变。目前尚不明确是否血浆中所有的mRNA都具有较强的稳定性。因此，有必要研究存放温度及处理时间对孕妇血浆中C21orf105、PLAC4 mRNA稳定性的影响。作者对此进行了探讨，研究结果显示，存放时间和温度对孕妇血浆中C21orf105、PLAC4 mRNA水平无明显影响,孕妇血浆中的胎儿游离C21orf105、PLAC4 mRNA具有极强的稳定性，同Ng等[3]的研究结论相一致。孕妇血浆中胎儿游离C21orf105、PLAC4 mRNA能在室温中稳定存在72 h，且仍具有扩增能力，这种稳定性有利于对母体血浆中C21orf105、PLAC4 mRNA的检测。

21-三体综合征胎儿的胎盘发育发生改变，滋养层细胞凋亡增加，母胎界面细胞释放增加[7]，理论上胎儿21-三体综合征孕妇外周血中由21号染色体编码的mRNA表达量高于正常胎儿孕妇，但是目前研究中，孕妇血浆C21orf105、PLAC4 mRNA表达量与胎儿21-三体综合征的关系存在争议。程蔚蔚等[6]研究发现胎儿21-三体综合征孕妇血浆中C21orf105 mRNA水平明显高于正常胎儿孕妇；但是Go等[4]的研究表明,21-三体综合征胎儿孕妇与正常胎儿孕妇血浆中C21orf105 mRNA表达量并无显著差异。2008年Banzola等[7]研究发现，与正常胎儿孕妇血浆中PLAC4 mRNA表达水平相比，21-三体综合征胎儿孕妇血浆中PLAC4 mRNA表达水平没有显著改变；2010年Tsui等[8]应用real-time PCR法测定孕妇血浆中PLAC4 mRNA表达量，发现21-三体综合征胎儿孕妇PLAC4 mRNA表达量明显高于正常胎儿孕妇。该研究中，作者采用实时荧光定量RT-PCR方法，以β-actin为内参，检测了38例21-三体综合征胎儿孕妇及40例年龄、孕周相匹配的正常胎儿孕妇血浆中C21orf105、PLAC4 mRNA的表达量，结果显示，21-三体综合征胎儿孕妇血浆中C21orf105、PLAC4 mRNA表达量高于正常胎儿孕妇，提示孕妇外周血中C21orf105、PLAC4 mRNA检测有望成为21-三体综合征产前筛查的有效指标。

综上所述，孕妇血浆中胎儿C21orf105、PLAC4 mRNA具有较强的稳定性，室温中稳定存在72 h仍具有扩增能力。在以后的研究或临床应用中，可以对在室温中存放3 d的全血标本进行检测，以便于基层医院对标本的储存及运送，实现一次性检测更多的病例，可大大节约人力、物力，降低研究成本。母体血浆中C21orf105、PLAC4 mRNA可能成为21-三体综合征产前筛查的有效指标。

参考文献

[1]ZHANG YC,LIU HQ,CHEN XL,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of down syndrome in samples from southwest chinese gravidas using pregnant plasma placental RNA allelic ratio[J].Genet Test Mol Biomarkers,2012,16(9):1051

[2]LI PQ,ZHANG J,FAN JH,et al.Development of noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21 by RT-MLPA with a new set of SNP markers[J].Arch Gynecol Obstet,2014,289(1):67

[3]NG EK,TSUI NB,LAM NY,et al.Presence of filterable and nonfilterable mRNA in the plasma of cancer patients and healthy individuals[J].Clin Chem,2002,48(8):1212

[4]GO AT,VISSER A,MULDERS MA,et al.C21ORF105,a chromosome 21-encoded mRNA,is not a discriminative marker gene for prediction of Down syndrome in maternal plasma[J].Prenat Diagn,2007,27(2):146

[5]刘红英,杨利丽,厉锋,等.孕妇外周血中胎儿特异性mRNA的筛选及其临床意义[J].中华妇产科杂志,2011,46(9):655

[6]程蔚蔚,赵欣荣,张华,等.孕妇血浆中胎儿游离mRNA检测在唐氏综合征产前诊断中的应用[J].中国实用妇科与产科杂志,2010(1):53

[7]BANZOLA I,RUSTERHOLZ C,ZANNONI L,et al.PLAC4 and β-HCG mRNA levels are not altered in the maternal circulation of pregnancies with trisomy 21[J].Prenat Diagn,2008,28(13):1262

[8]TSUI NB,AKOLEKAR R,CHIU RW,et al.Synergy of total PLAC4 RNA concentration and measurement of the RNA single-nucleotide polymorphism allelic ratio for the noninvasive prenatal detection of trisomy 21[J].Clin Chem,2010,56(1):73

[9]TSUI NB,WONG CS,CHOW KC,et al.Investigation of biological factors influencing the placental mRNA profile in maternal plasma[J].Prenat Diagn,2014,34(3):251

[10]OKAZAKI S,SEKIZAWA A,PURWOSUNU Y,et al.Measurement of mRNA of trophoblast-specific genes in cellular and plasma components of maternal blood[J].J Med Genet,2006,43(9):e47

[11]HEUNG MM,JIN SN,TSUI NB,et al.Placenta-derived fetal specific mRNA is more readily detectable in maternal plasma than in whole blood[J].PLoS One,2009,4(6):e5858

[12]NG EK,TSUI NB,LAU TK,et al.mRNA of placental origin is readily detectable in maternal plasma[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(8):4748

中图分类号R714.5

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.016

*河南省基础与前沿技术研究计划项目132300410197