N-乙酰-D-乳糖胺、抗CD28单克隆抗体对肺癌患者来源的CIK细胞增殖及杀伤功能的影响*

2016-04-19石晓娟乔永涛杨双宁黄建敏

郑州大学学报（医学版） 2016年2期

关键词：单克隆乳糖乙酰

石晓娟，乔永涛，杨　黎，杨双宁，黄建敏，赵　璇，李　红，张　毅

1)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心郑州 450052　2)郑州大学第一附属医院肿瘤科郑州 450052　3)郑州市第七人民医院临床营养科郑州 450000　4)河南省肿瘤免疫治疗工程技术研究中心郑州 450052

N-乙酰-D-乳糖胺、抗CD28单克隆抗体对肺癌患者来源的CIK细胞增殖及杀伤功能的影响*

石晓娟1,2)，乔永涛3)，杨黎1)，杨双宁1)，黄建敏1)，赵璇1)，李红1)，张毅1,2,4)#

1)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心郑州 4500522)郑州大学第一附属医院肿瘤科郑州 4500523)郑州市第七人民医院临床营养科郑州 4500004)河南省肿瘤免疫治疗工程技术研究中心郑州 450052

关键词N-乙酰-D-乳糖胺；CIK细胞；抗CD28单克隆抗体；细胞增殖；杀伤功能；肺肿瘤

摘要目的：观察N-乙酰-D-乳糖胺联合抗CD28单克隆抗体对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)增殖及杀伤功能的影响。方法：提取32例肺癌患者的外周血单个核细胞，分为对照组、抗CD28单克隆抗体组、N-乙酰-D-乳糖胺组及抗CD28单克隆抗体和N-乙酰-D-乳糖胺联合组(联合组)，依据CIK细胞培养流程培养和分组处理后于第4、8、10、12、14天测定各组细胞增殖，第14天测定IL-2、IL-10、γ干扰素及肿瘤坏死因子-α的分泌及对K562细胞的杀伤作用。结果：抗CD28单克隆抗体、N-乙酰-D-乳糖胺单独作用均能促进CIK细胞增殖及IL-2及肿瘤坏死因子-α的分泌，增加效应细胞(CD3+CD8+细胞)的比例，增强CIK细胞对K562细胞的杀伤能力(P<0.05)，但二者联合没有协同效应(P>0.05)。结论：N-乙酰-D-乳糖胺与抗CD28单克隆抗体均能增强CIK细胞增殖及杀伤功能，但二者无协同作用。

Effects of LacNAc and anti-CD28 mAb combination on proliferation and killing function of cytokine-induced killer cells from patients with lung cancer

SHIXiaojuan1,2)，QIAOYongtao3)，YANGLi1)，YANGShuangning1)，HUANGJianmin1)，ZHAOXuan1)，LIHong1)，ZHANGYi1,2,4)

1)BiotherapyCenter,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500523)DepartmentofClinicalNutrition,ZhengzhouNO.7People'sHospital,Zhengzhou4500004)EngineeringandTechnologyResearchCenterforTumorImmunotherapyofHenanProvince，Zhengzhou450052

Key wordsLacNAc;CIK cell;anti-CD28 mAb;cell proliferation;killing function;lung neoplasm

AbstractAim: To study the influence of LacNAc with or without anti-CD28 mAb on the proliferation and function of CIK cells from patients with lung cancer.Methods: The peripheral blood was collected from 32 patients with lung cancer.The monocytes were extracted and divided into four groups after suspension, control group,anti-CD28 mAb group,LacNAc group,and anti-CD28 mAb combined with LacNAc group(combined group),then cultured as CIK technological process and treated accordingly. The ability of proliferation was measured on the day of 4th, 8th, 10th, 12th, and 14th.IFN-γ,TNF-α,IL-2 and IL-10 secreted by CIK cells were measured on the 14th day. Phenotypic analysis via flow cytometry and anti-tumor affection on K562 cells via CCK-8 assay were performed on the 14th day.Results: The proliferation of CIK cells was significantly enhanced by LacNAc or anti-CD28 mAb. The cytokine secretion，ratio of effector cells(CD3+CD8+cells) and killing efficiency of CIK cells all improved after being treated by LacNAc or anti-CD28 mAb(P<0.05),but there was no interaction between LacNAc and anti-CD28 mAb(P>0.05).Conclusion: It is indicated that CIK cells treated with LacNAc or anti-CD28 mAb exhibit a potential in cytotoxic activity against tumor cells, but there is no interaction between them.

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells，以下简称CIK细胞)是一群具有多种细胞分型的免疫细胞，具有增殖能力高、细胞毒性强等优点，在肿瘤的生物治疗中具有极大的应用价值[1]。CIK细胞由源于外周血的单个核细胞经多种细胞因子如IL-2、IFN-γ等刺激而获得[2-3]。目前对CIK细胞临床疗效的研究[4-5]初步显示其对肺癌、乳腺癌、食管癌、肾癌等多种恶性肿瘤均有良好的疗效。N-乙酰-D-乳糖胺(N-Acetyl-D-lactosamine，LacNAc)具有半乳糖残基，与Galectin-3结合后能够激活细胞内部的相关信号通路，刺激细胞的扩增及功能的增强[6]。CD28作为细胞表面活化的第二信号分子，可促进T细胞的活化，但其对CIK细胞的作用仍不十分清楚。作者观察了LacNAc及抗CD28单克隆抗体(抗CD28 mAb)对CIK细胞增殖及靶细胞杀伤功能的影响，探讨二者在CIK细胞培养中的作用，为肿瘤的生物治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1试剂与仪器酶标仪(美国Sigma公司)，FACS流式分析仪(美国BD公司)，恒温培养箱，台式离心机，超净工作台，高压消毒锅，倒置显微镜。LacNAc、抗CD28 mAb、二甲基亚砜、IFN-γ、抗CD3单克隆抗体、人重组白细胞介素-2(IL-2)均购自美国Sigma公司，RPMI 1640培养基(美国HyClone公司)，PE-CY7-CD3、percp-CD4、APC-CY7-CD8均购自美国BD公司，小牛血清(天津市正江高科技公司)，人淋巴细胞分离液(上海四季青公司)，IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10 ELISA试剂盒均购自美国Biolegend公司，Cell Counting Kit-8试剂(CCK-8)(碧云天生物技术研究所)；白血病K562细胞购自美国细胞库。

1.2标本来源选取2012年8月至2013年9月于郑州大学第一附属医院就诊、经病理确诊为肺癌的患者32例，其中男18例，女14例，年龄39～72(53.8±9.4)岁。在患者知情同意并且不影响病情及治疗的情况下采集外周血10 mL。该研究经医院伦理委员会批准。

1.3K562细胞的培养于含体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养基，37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养。

1.4CIK细胞的培养与分组使用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，加入含体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养基，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育2 h，收集未贴壁细胞，分为4组，分别是对照组、抗CD28 mAb组、LacNAc组和LacNAc联合抗CD28 mAb组(联合组)。细胞培养第1天加1 000 U/mL IFN-γ，第2天加1 000 U/mL IL-2及抗CD3单克隆抗体(25 μg/L)。同时根据以上分组，在细胞培养第1天添加LacNAc(10 μg/L)或抗CD28 mAb(1 μg/L)。37 ℃、体积分数5%CO2培养箱培养至第14天，每3 d半量换液1次，按1 000 U/mL添加IL-2，同时相应添加LacNAc(10 μg/L)和抗CD28 mAb(1 μg/L)。

1.5CIK细胞体外增殖能力的检测在显微镜下观察各组CIK细胞的生长状况。分别于第4、8、10、12、14天取均匀分布的细胞悬液，在200倍镜下计数细胞，并以第1天细胞数为参照计算细胞增殖倍数。

1.6CIK细胞分泌细胞因子的能力检测以上各组在培养至第12天时取CIK细胞，生理盐水洗2次，离心后加不含细胞因子的培养基重悬，培养48 h后离心取上清，使用ELISA试剂盒检测CIK细胞分泌IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-2的能力。

1.7CIK细胞免疫表型分析取以上各组诱导培养第14天的CIK细胞，离心洗涤后加入免疫荧光抗体或相应的同型抗体(PE-CY7-CD3，percp-CD4，APC-CY7-CD8)进行染色，混匀后4 ℃避光孵育15 min，流式细胞术检测CIK细胞免疫表型。

1.9统计学处理应用SPSS 18.0处理数据。采用析因设计的方差分析观察抗CD28 mAb、LacNAc单用及联合对CIK细胞体外增殖能力，分泌IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-2的能力，细胞免疫表型及对K562细胞杀伤活性的影响，检验水准α=0.05。

2结果

2.1各组CIK细胞处理不同时间的增殖倍数比较

结果见表1。外周血单个核细胞在加入IFN-γ、IL-2以及抗CD3单克隆抗体刺激后，细胞体积增大，胞质变丰富，细胞核增大。从第4天细胞开始聚集并成簇状生长，且细胞增殖明显加快。由表1可知，与对照组相比，抗CD28 mAb组从第8天细胞增殖增强，而LacNAc组从第12天细胞增殖增强，但二者联用对细胞增殖无协同作用。

表1　各组CIK细胞处理不同时间的增殖倍数比较(n=32)

2.2各组CIK细胞分泌细胞因子的能力比较结果见表2。由表2可知，抗CD28 mAb对CIK细胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2 有促进作用，对IL-10无作用，LacNAc对TNF-α和IL-2有促进作用，对IFN-γ和IL-10无作用，但二者无协同作用。

表2　各组CIK细胞

2.3各组CIK细胞免疫表型比较9例患者获流式细胞术的结果，见表3。由表3可知，抗CD28 mAb、LacNAc单用增高了CD3+CD8+细胞比例，降低了CD3+CD4+细胞比例，但二者无协同作用。

表3　各组CIK细胞的细胞表型所占比例(n=9)　%

2.4各组CIK细胞对K562细胞的杀伤能力抗CD28 mAb和LacNAc对CIK细胞的杀伤活性均有增强作用，但二者无协同作用,见表4。

表4　各组CIK细胞对K562细胞的杀伤效能比较(n=32)

F抗CD28 mAb=173.075，P<0.001；FLacNAc=13.719，P<0.001；F交互=1.430，P=0.234。

3讨论

CIK细胞是目前用于过继免疫治疗最多的效应细胞[7]，其增殖及功能受多种因素影响[8]。该研究结果显示LacNAc、抗CD28 mAb均可促进CIK细胞的增殖，但二者无协同效应。研究[9]显示，抗CD28 mAb与CD28结合可提供细胞表面活化的第二信号，从而促进T细胞增殖。根据文献[10]报道，CTL表面的Galectin-3可限制TCR与CD8的共区域化，从而限制T细胞的激活，而富含半乳糖残基的LacNAc能与Galectin-3结合，释放TCR与CD8共区域化，使T细胞对激活信号更加敏感，进而增强T细胞的增殖能力和杀伤能力。

通过检测细胞因子的分泌量可鉴定CIK细胞的功能[11]，而这些细胞因子可以与CIK细胞联合发挥抗肿瘤作用[12]。一些研究[13-15]结果表明抗CD28 mAb对CIK细胞分泌细胞因子均有促进作用，同时抗CD28 mAb与LacNAc具有一定的协同作用。该研究发现LacNAc、抗CD28 mAb促进了CIK细胞分泌TNF-α、 IFN-γ等细胞因子，但二者并无协同作用。CIK细胞分泌的细胞因子可以直接发挥抗肿瘤作用并提高CIK细胞对肿瘤细胞的敏感性，增加CIK对肿瘤细胞的识别和杀伤。

通过使用流式细胞分析仪对所培养细胞的表型进行分析，结果显示LacNAc及抗CD28 mAb均可以提高CD3+CD8+细胞比例，减少CD3+CD4+细胞比例。说明一定量的LacNAc和抗CD28 mAb可能会选择性地增强功能性CIK细胞的扩增，同时又不促进免疫抑制性细胞的扩增。这一结果为通过体外扩增肿瘤患者CIK细胞，获得较好质量的细胞，提高其抗肿瘤免疫功能，提供了一定的免疫学依据。

此外，该实验结果表明LacNAc、抗CD28 mAb可提高CIK细胞对靶细胞的杀伤活性，但二者无协同作用。已有研究[16]显示CIK细胞在体外培养后，CD4+细胞比例降低而CD8+细胞比例升高，提示获得的CIK细胞含有更多比例的效应细胞。因此该实验中CIK细胞对靶细胞的高杀伤效应可能与效应细胞比例提高有关。

综上所述，该研究证实了LacNAc、抗CD28 mAb可以提高CIK细胞的增殖能力、提高其分泌细胞因子的能力、促进功能性CIK细胞的增殖并增强CIK细胞对靶细胞的杀伤功能，但是二者并无协同作用，还需要进一步验证或从信号通路等方面探讨其机制。

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