抗菌肽产生菌Brevibacillus laterosporus S62- 9最适发酵条件的优化

李宁，剧建格，于宏伟，贾英民（.河北农业大学食品科技学院，河北保定0700；2.河北科技大学，河北石家庄05008）



抗菌肽产生菌Brevibacillus laterosporus S62- 9最适发酵条件的优化

李宁1，剧建格1，于宏伟1，贾英民2，*
（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001；2.河北科技大学，河北石家庄050018）

摘要：探讨侧孢短芽孢杆菌S62-9的发酵培养基和发酵条件对产抗菌肽的影响，通过单因素试验，确定了3个显著因素，采用正交试验对产抗菌肽的发酵培养基组成进行了优化，并确定了最佳发酵条件。结果表明，S62-9产抗菌肽的最佳培养基组成和发酵条件：糊精1%、蛋白胨2%、CaCl20.15%、Tween-201.5%；起始pH为7.0，装液量为40mL/300mL，以3%的接种量于37℃，250r/min摇床培养22h。在此条件下产抗菌肽较优化前相比提高了59.9%。

关键词：侧孢短芽孢杆菌；抗菌肽；发酵条件；优化

由细菌产生的抗菌肽是近年来人们广泛研究的一种生物防腐剂。能够产生抗菌肽的细菌种类繁多，将其作为天然生物防腐剂用于食品工业的多集中在乳酸链球菌素（nisin）[1-2]。侧孢短芽孢杆菌是细菌素的一个新来源[3]，其产生的抗菌肽具有耐热性高、抑菌谱广等优点，在食品保藏中具有广阔的应用前景[4-5]，国外相关的研究报道较少[6-7]。国内有关侧孢短芽孢杆菌发酵产抗菌肽的研究也愈来愈广泛[8-10]。本试验以营养肉汤（NB）为基础培养基，通过单因素试验及正交试验，以期最终获得侧孢短芽孢杆菌S62-9产抗菌肽的最佳培养基组成和最佳发酵条件。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

侧孢短芽孢杆菌S62-9（Brevibacillus laterosporus S62-9）：由本实验室保存。

1.1.2主要培养基

1）斜面培养基：蛋白胨1 %，牛肉膏0.3 %，NaCl 0.5 %，琼脂1.5 %～2 %，pH调至7.2～7.4，121℃20 min；

2）种子培养基：蛋白胨1 %，牛肉膏0.3 %，NaCl 0.5 %，pH调至7.2～7.4，121℃20 min；

3）发酵培养基：糊精1%、蛋白胨2%、CaCl20.15%、Tween-20 1.5 %，pH调至7.2～7.4，121℃20 min。

1.2方法

1.2.1抑菌活性的测定

抗菌肽抑菌活性的测定采用琼脂扩散法[11]。以S. aureus为指示菌，用无菌生理盐水将其稀释到107cfu/mL，取1 mL指示菌菌悬液置于直径为90 mm的标准平板中，再准确吸取20 mL冷却至40℃～50℃的营养琼脂倒入板中混匀，使之形成均匀一致的指示菌平板。用直径6 mm打孔器在指示平板上打孔，向孔中加入发酵上清液50 μL，置于37℃恒温静置培养箱中培养24 h，用游标卡尺测量透明圈直径（mm）。

1.2.2产抗菌肽发酵条件的优化[12-13]

利用斜面培养基活化菌株S62-9，37℃培养18 h，后接种一环于种子培养基中（装液量50 mL/300 mL），37℃、200 r/min培养18 h制成种子液，以2 %接种发酵培养基进行摇瓶发酵（装液量为50 mL/300 mL），37℃、200 r/min培养20 h。

1.2.2.1培养基营养成分的优化

在发酵培养基中，依次添加不同碳源、氮源、无机盐以及表面活性剂，测定抑菌活性，以不加的基础培养基为对照（CK），设对照的抑菌直径为100 %。确定出单因素组分和添加量。在单因素试验的基础上，设糊精、蛋白胨、Tween-20和CaCl24个因素，每个因素设3个水平，进行摇瓶发酵试验，通过L9（34）正交试验确定最佳发酵培养基，寻找最佳发酵培养基成分[11-12]。正交试验因素水平表如下：

表1正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

1.2.2.2发酵工艺条件的优化

在优化后的培养基基础上，分别选择不用的起始pH、发酵温度、接种量以及溶氧量，其它条件不变，进行摇瓶发酵试验，测定抑菌活性。

2　结果与分析

2.1发酵培养基的优化

2.1.1不同碳源的影响

不同碳源对产抗菌肽的的影响如表2所示。

碳源是培养基的主要成分之一，适合的碳源对菌体的生长以及抑菌肽的的产生具有重要作用。分别选取2种单糖（葡萄糖、甘露醇）、3种双糖（麦芽糖、蔗糖和乳糖）和2种多糖（糊精和壳聚糖）以1 %的添加量进行研究。由表2可以看出，甘露醇和麦芽糖对抑菌肽的产生有抑制作用，而糊精却有利于抗菌肽的产生。

表2不同碳源对产抗菌肽的的影响Table 2 Effect of different carbon source on production of antibacterial peptide

糊精添加量对产抗菌肽的影响如图1所示。

图1糊精添加量对产抗菌肽的影响Fig.1 Effect of dextrin on antibacterial pepide

通过进一步试验（图1）可知，1%的糊精添加量抑菌活性最高。但随添加量的增加，反而抑制了抑菌活性。

2.1.2不同氮源的影响

不同氮源对产酶的影响如表3所示。蛋白胨添加量对产抗菌肽的影响如图2所示。

表3不同氮源对产酶的影响Table 3 Effect of different nitrogen source on production of antibacterial peptide

由表3可知，各种氮源对抗菌肽的产生均有一定的促进作用，其中蛋白胨对产抗菌肽有较大影响，而KNO3和NH4SO4对抗菌肽的产生也有一定的促进作用。图2表明，抑菌活力随着蛋白胨添加量的增加而升高，当增加到3.0 %时，抑菌活力有所下降。

2.1.3无机盐的影响

无机盐对产抗菌肽的影响如图3所示，CaCl2对产抗菌肽的影响如图4所示。

图2蛋白胨添加量对产抗菌肽的影响Fig.2 Effect of peptone on antibacterial pepide

图3无机盐对产抗菌肽的影响Fig.3 Effect of inorganic salt on antibacterial pepide

图4 CaCl2对产抗菌肽的影响Fig.4 Effect of CaCl2on antibacterial pepide

无机盐在微生物的生长繁殖和代谢过程中是不可缺少的，并对细胞内外的pH，氧化还原电位和渗透压具有调节作用。

由图3和图4可知，CaCl2对抗菌肽的产生有明显的促进作用，且添加量在0.01%～0.15%时，抑菌活性随CaCl2添加量的增加逐渐升高，0.15%浓度时抑菌活性最大。随着CaCl2浓度继续增加，抑菌活性反而逐渐下降。2.1.4表面活性剂的影响

在培养基中加入表面活性剂Tween-80、Tween-20有利于抗菌肽的产生。结果如图5、图6所示。

两种表面活性剂均对产抗菌肽有促进作用，添加1.0 %的Tween-20时抑菌活性最高。作为乳化剂，Tween可降低细菌菌体与培养基之间的表面张力，从而改善微生物细胞膜的通透性，提高了细胞膜的通透性、刺激了抗菌肽的产生。

图5表面活性剂对产抗菌肽影响Fig.5 Effect of surfactants on antibacterial pepide

图6 Tween-20添加量对产抗菌肽的影响Fig.6 Effect of Tween-20 on antibacterial pepide

2.1.5培养基组成的正交试验

在单因素试验结果基础上，设计正交试验来综合考虑糊精、蛋白胨、CaCl2和Tween-20对产抗菌肽的影响，见表3、表4。

表3 L9（34）正交试验结果Table 3 Results of orthogonal test L9（34）

表4正交试验方差分析Table 4 Variance analysis of Orthogonal test

由表3中的极差值可知，CaCl2对产抗菌肽的影响最大，其次是糊精，蛋白胨及Tween-20影响最小。产抗菌肽的最优组合是A2B1C2D3，即1 %糊精、2 %蛋白胨、0.15 % CaCl2和1.5 % Tween-20。根据单因素及正交试验结果，确定培养基的优化配比为：1 %糊精、2 %蛋白胨、0.15 %CaCl2以及1.5 % Tween-20。

2.2发酵条件的优化

2.2.1初始pH的影响

由于摇瓶中培养基的pH在发酵过程中一直在变化，不易控制。方便起见，试验中只考虑培养基起始pH对产抗菌肽的影响。分别设定发酵液起始pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，固定其它发酵条件，进行摇瓶发酵试验，测定抑菌活性。初始pH的对产抗菌肽影响如图7所示。

图7初始pH的对产抗菌肽影响Fig.7 Effect of initial pH on antibacterial pepide

由图7可知，发酵培养基的适宜起始pH在7.0～8.0范围内，抑菌活性较高。pH不仅会对发酵液或代谢产物产生物理化学的影响，还会对产物稳定性产生影响。因此确定发酵液的初始pH为7.0。

2.2.2培养温度的影响

温度对微生物生长繁殖的有较大影响[14]。将发酵温度分别设定为25、30、37℃和42℃，固定其它发酵条件，进行摇瓶发酵试验，测定抑菌活性。培养温度对产抗菌肽的影响如图8所示。

图8培养温度对产抗菌肽的影响Fig.8 Effect of culturing temperature on antibacterial pepide

从图8可知，菌株S62-9在37℃时抗菌肽活性最高，因此确定37℃为产抗菌肽的最适发酵温度。

2.2.3最佳接种量的确定

接种量分别设定为1 %、2 %、3 %、4 %、5 %和6 %，固定其它发酵条件，进行摇瓶发酵试验，12 h后测定抑菌活性。接种量对产抗菌肽的影响如图9所示。

图9接种量对产抗菌肽的影响Fig.9 Effect of inoculation on antibacterial pepide

由图9可知，当接种量达到3 %时，抗菌肽的活性最高。因此，确定S62-9发酵产抗菌肽的最佳接种量为3 %。

2.2.4溶氧量的影响

适量的氧气供给有利于菌体的生长和代谢，供氧不足或供氧过多都会严重地影响微生物的生理代谢。在摇瓶条件下，溶解氧的高低可以通过改变三角瓶的装液量和摇床转速来控制。结果如图10和图11。

侧胞短芽孢杆菌S62-9是兼性厌氧菌，提高培养基中的溶氧量有利于抗菌肽的合成，鉴于摇床的承受能力，确定转速为250 r/min，液量为40 mL/300 mL最利于抗菌肽的产生。

3　结论

图10转速对产抗菌肽的影响Fig.10 Effect of shaking rate on production of antibacterial peptide

图11装液量对产抗菌肽的影响Fig.11 Effect of liquid volume on production of antibacterial pepide

本试验通过单因素试验及正交试验，获得侧胞短芽孢杆菌S62-9产抗菌肽的最佳培养基组成和发酵条件：糊精1 %、蛋白胨2 %、CaCl20.15 %、Tween-20 1.5 %；起始pH为7.0，装液量为40 mL/300 mL，以3 %的接种量于37℃，250 r/min摇床培养22 h。在此条件下产抗菌肽较优化前相比提高了59.9 %。结果表明，对发酵产抗菌肽影响最显著的是CaCl2，当浓度在0.01 %～0.15 %时，抗菌肽活性随添加量的增加而升高，但当浓度大于0.15 %时，抑菌活性反而下降。其原因可能是因为Ca2+是抗菌肽合成酶必不可少的辅助因子，对抗菌肽的生物合成起到调节作用。Ca2+浓度在一定范围内能够促进抗菌肽的合成，而高浓度Ca2+不利于抗菌肽的合成。该结果与童应凯等人的研究结果一致[15]。糊精对发酵产抗菌肽影响显著，可能是菌株利用糊精速度缓慢，可在代谢过程中形成酸性环境；而在菌体生长后期，仍有足够的碳源从而有利于抗菌肽的积累。本试验中培养基起始pH对发酵产抗菌肽具有较大的影响，初始pH在7.0～8.0范围时发酵液中抗菌肽的抑菌活性较高，pH过高或过低均不利于抗菌肽的产生。

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Studies on the Fermentation Conditions of Antibacterial Peptide from Brevibacillus laterosporus S62-9

LI Ning1，JU Jian-Ge1，YU Hong-Wei1，JIA Ying-min2，*
（1. College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，Hebei，China；2. Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China）

Abstract：The optimal medium compositions and the optimal cultural conditions of antibacterial peptide produced by Brevibacillus laterosporus S62-9 were discussed. Different factors were investigated such as the ingredients of medium，temperature，pH，inoculating amount and medium capacity on production of antibacterial peptide in order to optimize fermentation condition of S62-9. The optimal results were dextrin 1 %，peptone 2 %，CaCl20.15 %，Tween-20 1.5 %. Through shake-flask experiments，the best culture conditions were pH 7.0，40 mL/300 mL，250 r/min and 3 % inoculation，37℃for 22 h. Cultured in this condition，the yield of antibacterial peptide increased 59.9 % compared with initial fermentative conditions.

Key words：Brevibacillus laterosporus；antibacterial peptide；fermentation conditions；optimization

收稿日期：2014-10-27

*通信作者：贾英民（1961—），男（汉），教授，博士生导师，从事食品微生物研究。

作者简介：李宁（1980—），女（汉），副研究员，在读博士研究生，研究方向：食品微生物。

基金项目：河北省自然基金项目“侧孢短芽孢杆菌抗菌肽对食源性金黄色葡萄球菌的抑菌机理研究”（C2014208137）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.046