金钱草总黄酮提取液抑制大鼠草酸钙结石形成机制的研究

陶婷婷 吕伯东 黄晓军 傅骏 马寅锋

浙江中医药大学附属第二医院泌尿外科，浙江杭州310005

金钱草总黄酮提取液抑制大鼠草酸钙结石形成机制的研究

陶婷婷 吕伯东 黄晓军 傅骏 马寅锋

浙江中医药大学附属第二医院泌尿外科，浙江杭州310005

目的探讨金钱草总黄酮提取液抑制大鼠草酸钙结石形成机制的研究。方法常规饲养大鼠1周，采用乙二醇饮水和氯化铵灌胃造模草酸钙结石大鼠模型，将30只SD大鼠随机分为空白对照组（A组）、草酸钙结石模型组（B组）和金钱草总黄酮组（C组）。给药4周后收集各组大鼠24 h尿液，检测尿pH值及24 h尿钙、尿草酸、尿酸、尿葡胺聚糖和尿凝血酶原片段-1的含量。结果金钱草总黄酮组大鼠24 h尿量较草酸钙结石模型组增加，差异有统计学意义（P＜0.05），与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。金钱草总黄酮组大鼠与草酸钙结石模型组大鼠比较，其24 h尿钙和尿草酸含量均降低，而尿凝血酶原片段-1的含量增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而三组间尿pH值、尿酸经比较均无明显差异（P＞0.05）。结论金钱草总黄酮提取液可能通过增加大鼠24 h尿量，降低尿液中成石因子-尿钙和尿草酸的含量，增加尿液中抑石因子-尿凝血酶原片段-1含量，从而抑制草酸钙结石的形成。

草酸钙；结石；金钱草总黄酮；凝血酶原片段-1

泌尿系结石是泌尿科最常见的疾病［1］，在欧美国家，5%～10%在一生中至少发生一次泌尿系结石，欧洲泌尿系结石年新发病率约100/10万～400/10万人［2］。我国泌尿系结石发病率为1%～5%，年新发病率约150/10万～200/10万人［3］。泌尿系结石的成分有草酸钙、磷酸钙、尿酸、磷酸镁铵、胱氨酸等，其中草酸钙及含草酸钙的结石约占泌尿系结石的80%以上［4］。

泌尿系结石的形成受到尿液中许多成分的影响，如尿中钙、草酸等成分促进结石生成，称为成石因子。而尿液中又有许多抑制结石形成的物质，它们在正常人尿液中浓度或活力高，而在结石患者中含量低。这些抑石因子大体可分为小分子抑制物和大分子抑制物，其中小分子抑制物包括枸橼酸盐、镁、焦磷酸盐、α-亚麻酸等［5］，而大分子抑制物包括肾钙素、蛋白多糖、骨桥蛋白、凝血酶原片段、α-胰蛋白酶抑制物片段、核糖核酸、酸性黏多糖、黏液素［6-8］。成石抑制物的研究已成为泌尿系结石的重要研究方向。

中医药治疗泌尿系结石有悠久的历史，疗效显著，且副作用少，但中草药抑制结石形成的机制报道甚少，至今尚不清楚，尤其是对其中单味中药的研究更少。金钱草是目前大多数排石方剂中最常见的一味要药［9］，其中黄酮类化合物为其主要成分［10，11］，本次研究旨在观察金钱草总黄酮类化合物对尿液中成石因子和抑石因子等成分的影响，从而探讨金钱草防治草酸钙结石的机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用8周龄SD健康雄性大白鼠30只，体重200～250 g［浙江中医药大学动物实验中心提供，许可证编号：SCXK（沪）2008-0016］。

1.2 金钱草总黄酮提取液的制备

金钱草干燥全草（购于浙江中医药大学附属第二医院中药房）10 kg粉碎后经体积分数为80%乙醇提取，加热回流2次，每次3 h，回收得到约1 kg浸膏，通过溶剂萃取得到石油醚部分与水部分。水部分经大孔树脂柱色谱，以水-乙醇梯度洗脱，得到总黄酮部分约150 g，加入蒸馏水定容至1mg/L（由浙江中医药大学附属第二医院药剂科制备）。

1.3 草酸钙结石模型造模

采用1%乙二醇（EG）饮水+2%氯化铵（AC），每天灌胃2mL/只。

1.4 实验动物分组及给药方法

随机分为3组，每组10只。空白对照组（A组）：自来水饮水2 mL/只/d+生理盐水2 mL/只/d灌胃；草酸钙结石模型组（B组）：1%乙二醇（EG）饮水+2%氯化铵（AC）2 mL/只/d+生理盐水2 mL/只/d灌胃；金钱草总黄酮组（C组）：1%EG饮水+2%AC 2mL/只/d+金钱草总黄酮提取液2mL/只/d灌胃。各组大鼠均标准喂养，饲养5周，第1周先适应环境，从第2周开始给药。饲养环境：温度22℃～25℃，湿度：50%～60%。

1.5 观察指标

灌胃4周后大鼠单独置入代谢笼中，收集其24 h尿液，标本中加入0.02%叠氮化钠防止细菌分解，统计24 h尿量。检测24 h尿液中钙、草酸、pH值、尿酸、葡胺聚糖、凝血酶原片段-1的含量。尿钙、尿草酸、尿酸由我院生化室全自动生化仪检测。尿葡胺聚糖购买人糖胺聚糖（GAG）ELISA试剂盒（上海拜力生物科技有限公司）进行检测，凝血酶原片段-1购买人凝血酶原片段F1+2（F1+2）ELISA试剂盒（上海顺科生物科技有限公司）检测。

1.6 统计学处理

采用SPSS19.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多个样本均数比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组一般情况比较

A组大鼠毛色光泽，紧密贴身，双目有神，反应灵敏，食欲旺盛，饮水适度，体重增加较快，大便呈颗粒状，尿色淡黄。B组大鼠出现毛发欠光泽，饮食减少，活动量较少，尿量减少，大便稀溏。而C组精神饮食活动基本正常。经比较，三组间尿量差异有统计学意义（F=4.89＞F0.05（2，27），P＜0.05）。而A组和B组、B组和C组之间比较差异均有统计学意义（tAB=2.632，P＜0.05；tBC=2.873，P＜0.05），A组和C组间比较差异无统计学意义（t=1.324，P＞0.05），见表1。

表1 三组24 h尿量比较（±s，m L）

表1 三组24 h尿量比较（±s，m L）

注：与B组比较，*P＜0.05

组别n 24 h尿量空白对照组（A组）草酸钙结石模型组（B组）金钱草总黄酮组（C组）10 10 10 24.4±3.3*16.6±2.8 26.3±3.1*

2.2 三组尿钙、草酸、pH值、尿酸比较

三组间尿pH值（F=1.562，P＞0.05）、尿酸（F= 2.352，P＞0.05）比较差异无统计学意义。而三组间尿钙（F=4.156，P＜0.05）和尿草酸（F=5.112，P＜0.05）比较差异有统计学意义。A组和C组的尿钙和尿草酸含量明显低于B组，差异有统计学意义（尿钙：tAB=3.062，P＜0.05；tBC=2.973，P＜0.05；尿草酸：tAB=4.113，P＜0.05；tBC= 3.492，P＜0.05），见表2。

表2 三组尿钙、草酸、pH值、尿酸比较（±s）

表2 三组尿钙、草酸、pH值、尿酸比较（±s）

注：与B组比较，*P＜0.05

组别n pH值钙（mmol/L）草酸（mmol/L）尿酸（mmol/L）空白对照组（A组）草酸钙结石模型组（B组）金钱草总黄酮组（C组）10 10 10 6.74±0.35 6.49±0.23 6.60±0.38 1.32±0.41*3.78±0.31 2.05±0.37*0.78±0.21*2.13±0.59 1.20±0.33*0.78±0.07 0.81±0.06 0.85±0.19

2.3 三组尿葡胺聚糖和凝血酶原片断-1比较

三组间尿葡胺聚糖和凝血酶原片段-1的含量均有差异（F=4.968，P＜0.05）。B组的尿葡胺聚糖和凝血酶原片段-1的含量均较A组明显降低，差异有统计学意义（t葡胺聚糖=2.362，P＜0.05，t凝血酶原片段-1=3.718，P＜0.05）。C组的尿葡胺聚糖含量比B组有所增加，但差异尚无统计学意义（t=1.894，P＞0.05），而尿凝血酶原片段-1的含量与B组比较差异有统计学意义（t=4.137，P＜0.05），见表3。

表3 三组尿葡胺聚糖、凝血酶原片段-1比较（±s）

表3 三组尿葡胺聚糖、凝血酶原片段-1比较（±s）

注：与B组比较，*P＜0.05

组别n 葡胺聚糖（mg/L）凝血酶原片段-1（nmol/L）空白对照组（A组）草酸钙结石模型组（B组）金钱草总黄酮组（C组）10 10 10 0.85±0.04*0.78±0.15 0.81±0.23 0.08±0.02*0.03±0.01 0.12±0.02*

3 讨论

泌尿系结石是人体尿液中固体成分析出而形成，是人体内的一种病理性生物矿化。病因复杂，大致包括代谢异常、遗传因素、尿路局部因素（感染、梗阻、异物等）等个体因素，以及饮食、气候、药物、职业等环境因素。目前，泌尿系结石的形成机制尚未明确，目前已知有多种学说与之有关，如结石基质学、钙化斑学说、异质促进成核学说、过饱和结晶学等。但各类学说都是基于泌尿系结石的两大主要成分—晶体和基质进行研究。研究认为，成核是结石形成的起始步骤，然后按生长、聚集的过程进一步发展形成固相晶核的过程。因此，我们认为要想预防结石的发生，首先必须通过防止尿液浓缩或过饱和，增强成石抑制因素，减少促进因素等［12-14］措施阻断结石的成核过程。

金钱草是报春花科植物过路黄的干燥全草［15］，性甘、咸，微寒，归肝、胆、肾、膀胱经，具有清利湿热、通淋、消肿的作用，其含有酚性成分、黄酮类、甙类、鞣质、挥发油、氨基酸、胆碱、甾醇、氯化钾、内脂类等多种有效成分［16］，而对其中黄酮类物质的研究较为深入，目前已分离出10种黄酮类化合物，黄酮苷类化合物有预防乙二醇和维生素D3造成的大鼠草酸钙尿路结石形成的作用。现代药理研究表明：金钱草能增加尿量，增强输尿管蠕动，抑制结晶形成，调节尿液pH值，另外金钱草还具有消炎、止痛、抗氧化、抑制肝脏脂质过氧化等作用［16，17］。

本次研究采用1%的乙二醇和2%氯化铵诱导形成草酸钙结石大鼠。研究证实，大鼠服用乙二醇后可增加草酸的合成，促进草酸钙结晶的形成，而服用氯化铵后，可导致肾小管上皮损害，进行性功能障碍，有利于草酸钙结石的逐渐形成［18，19］。在整个实验过程中，模型组大鼠出现精神疲倦，毛发枯槁，活动减少，饮食少等一系列患病症状。实验结束时模型组与空白对照组比较，24 h尿量降低，而尿钙、尿草酸含量增加，差异有统计学意义（P＜0.05），表明草酸钙结石的存在，与泌尿系结石的临床特征基本吻合。可见，大鼠造模成功，且实验周期不长，方法经济、简单易行、成石率高、稳定性好，符合我们的实验要求。

研究显示［20］，金钱草中的黄酮类成分中的羧基和酚羟基可与尿液及晶体表面的钙离子络合，从而降低钙离子浓度，减小草酸钙的过饱和度，并能阻止晶体进一步生长、聚集以及互相转化，而其羟基还可以与草酸根的羧基发生强烈的氢键作用，降低草酸根离子浓度，减少尿液中草酸钙的过饱和度。本次实验通过金钱草总黄酮提取液每日灌胃，结果显示，4周后大鼠24 h尿量显著增加，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），而与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。并且，金钱草总黄酮组大鼠的24 h尿钙和尿草酸含量较模型组大鼠降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明金钱草总黄酮提取液可以通过增加尿量，降低24 h尿钙和尿草酸的含量，从而防止尿液的过饱和，抑制草酸钙结晶的形成。

目前研究证实，尿液中的很多大分子物质是结石基质的重要组成部分，如葡胺聚糖、尿凝血酶原片段-1、肾钙素、Tamm-Horsfall蛋白、间α胰蛋白酶抑制物等［21］，这些大分子物质能调节基质成核、聚集和生长，能促进或抑制结石的聚集和生长。而尿凝血酶原片段-1是草酸钙结石基质中含量最为丰富的大分子物质，被认为是最主要的内源性尿草酸钙结石形成抑制因子［22］。本课题通过对尿液中的大分子物质葡胺聚糖和尿凝血酶原片段-1的检测，发现模型组两者的含量均较空白对照组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。而造模后的大鼠每日给予金钱草总黄酮提取液后，尿葡胺聚糖含量比模型组有所增加，但差异尚无统计学意义（P＞0.05）。而尿凝血酶原片段-1的含量与模型组比较有统计学意义（P＜0.05），说明金钱草总黄酮能够通过增加尿液中尿凝血酶原片段-1的含量，从而抑制草酸钙结石的形成。大量研究已经证实尿凝血酶原片段-1［23，24］可能通过其与草酸钙晶体结合，封闭晶体表面的生长点，改变晶体的表面特性等机制抑制草酸钙晶体的生长和聚集。

综上所述，金钱草作为传统治疗泌尿系结石的植物药，其主要成分金钱草总黄酮提取物能有效抑制草酸钙结晶的形成，经过本课题对尿液中各项成分的研究，我们将其抑制草酸钙结晶可能的机制总结如下：①金钱草总黄酮类物质具有显著的利尿作用，可降低24 h尿钙和尿草酸的浓度，并且由于尿量的增加，尿液冲刷作用利于微小结石的排出。②金钱草总黄酮类物质可能通过增加尿液中凝血酶原片段-1的含量，从而抑制草酸钙结石的形成。但本课题尚未对泌尿系结石的全部影响因素进行研究，如骨桥蛋白、肾钙素、黏液素等。因此，需要进一步的试验研究全面了解金钱草总黄酮提取液对草酸钙结石的作用机制。

［1］叶章群，邓耀良，董诚.泌尿系结石［M］.北京：人民卫生出版社，2003.

［2］Turk C，Knoll T，Petrik A，et al.Chap 7：EAU guidelines on urolithiasis［M］.European Association of Urology，2010：27-28.

［3］那彦群.中国泌尿外科疾病诊断指南［M］.北京：人民卫生出版社，2014：129.

［4］Xu H，Zisman AL，Coe Fl，et al.Kidney stones：An update on current pharmacologicalmanagement and future directions［J］.ExpertOpin Pharmacother，2013，14（4）：435-447.

［5］王军，叶章群，宋波，等.α-亚麻酸对实验性大鼠前列腺素E及肾草酸钙结晶形成的影响［J］.第三军医大学学报，2005，27（23）：2341.

［6］李云龙，谢云，吴火焱，等.主要抑制物在尿石形成中作用机制的研究进展［J］.齐齐哈尔医学院学报，2008，29（16）：2015-2016.

［7］Aggarwal KP，Narulas S，Kakkar M，et al.Nephrolithiasis：Molecular mechanism of renal stone formation and the critical role played bymodulators［J］.Biomed Resint，2013，（2013）：292953.

［8］Joshi S，Clapp WL，Wang W，et al.Osteogenic changes in kidneys of hyeroxaluric rats［J］.Biochim Biophys Acta，2015，1852（9）：2000-2012.

［9］Huang HS，Ma MC，Chen J，et al.Changes in the oxidantantioxidant balance in the kidney of rats with nephrolithiasis induced by ethyleneglycol［J］.JUrol，2002，167（6）：2584-2593.

［10］陈小英，张瑞辉，黎婉红，等.对广金钱草不同部位总黄酮的含量分析［J］.中国医药指南，2014，12（13）：77-78.

［11］Li XL，Wang H，Liu G，et al.Study on the constituents from desmodium styracifolium［J］.Zhong Yao Cai，2007，30（7）：802-805.

［12］Evan AP.Physiopathology and etiology of stone formation in the kidney and the urinary tract［J］.Pediatr Nephrol，2010，25（5）：831-841.

［13］Rosemary Lyons Ryall.The possible roles of inhibitors，promoters，and macromolecules in the formation of calci um kidney stones［M］.Urinary Tract Dtone Disease，2010：31-60.

［14］Vishal N，Ratkalkar，Jcak G，et al.Mechanisms of stone formation［J］.Clinical Reviews in Bone and MineralMetabolism，2011，9（3）：187-197.

［15］国家药典委员会编.中华人民共和国药典［M］.中国医药科技出版社，2015.

［16］李静，贺绍君，刘德义.金钱草防治泌尿系统结石机理研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2015，17（3）：79-81.

［17］俞仑青.金钱草药理作用及临床应用概况［J］.中国现代药物应用，2011，5（14）：131-132.

［18］Khan SR，Glenton PA.Experimental induction of calcuim oxalate nephrolithiasis in mice［J］.JUrol，2010，184（3）：1189-1196.

［19］巴元明，曹秋实.两种草酸钙结石大鼠模型的比较研究［J］.上海交通大学学报（医学版），2014，34（11）：1595-1598.

［20］王萍，沈玉华，谢安建，等.金钱草提取液对尿液中草酸钙晶体生长的影响［J］.安徽大学学报（自然科学版），2006，30（1）：80-84.

［21］刘东锋，吴希庆，萨音白钢.泌尿系结石主要抑制物的研究进展［J］.包头医学院学报，2013，3（29）：124-126.

［22］Doyle IR，Ryall RL，Marshall VR.Inclusion of proteins into calcium oxalate crystals precipitated from human urine：Ahighly selective phenomenon［J］.Clin Chem，1991，37：1589-1594.

［23］Grover PK，RyallRL.Effectof prothrombin and itsactivation fragments on calcium oxalate crystal growth and aggregation in undiluted human urine in vitro：Ralationship between protein structure and inhibityory cativity［J］.Clin Sci，2002，102（4）：425-434.

［24］Ryall RL，Fleming DE，Grover PK，et al.The hole truth：Intracrystalline proteins and calcium oxalate kidney stones［J］.Mol Urol，2000，4（4）：391-402.

Study on the total flavone extract of lysimachia on calcium oxalate stone formation in rats

TAO Tingting LV Bodong HUANG Xiaojun FU Jun MA Yinfeng
Department of Urology Surgery，the Second Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310005，China

Objective To discuss themechanism of the total flavone extract of lysimachia on calcium oxalate stone formation in rats.M ethods Conventional breeding rats for aweek，the ratmodel of calcium oxalate stonewasmade by using ethylene glycol drinking water and ammonium chloride.30 adultmale SD ratswere randomized to three groups，the control group（group A），the stone group（group B），and the total flavone extract of lysimachia group（group C）.All rats were bred 4 weeks，the 24 hours'urine of rats were collected，and then the pH value，the calcium，oxalate acid，uric acid，the GAGs and the prothrombin fragment-1 of the urine were detected.Results The 24 hours'urine volume of the total flavone extract of lysimachia group were increased than the stone group，there was significant difference（P＜0.05），while therewas no significant difference compared with the control group（P＞0.05），and the calcium，oxalate acid of the urine of the total flavone extract of lysimachia group were reduced，and the urinary prothrombin fragment-1 increased compared with the stone group（P＜0.05），while there was no significant difference in pH value and uric acid of the urine among three groups（P＞0.05）.Conclusion The total flavone extract of lysimachia can increase the 24 hours'urine vol ume，and can decrease the promoting stone factors-calcium，oxalate acid of the urine，can increase the urinary prothrombin fragment-1，thereby inhibiting the formation of calcium oxalate stones.

Calcium oxalate；Stone；Total flavone extract of lysimachia；Urinary prothrombin fragment-1

R285.5

A

1673-9701（2016）18-0030-04

2016-01-27）

浙江省中医药优秀青年人才基金项目（2014ZQ 015）