鬼针草叶蛋白最佳提取时期与方法的筛选

谢先中，陈晓武，王永树

（1．贵州省黔西南民族职业技术学院生物工程系，贵州兴义562400；2．上海海洋大学水产与生命学院，上海201306）

鬼针草叶蛋白最佳提取时期与方法的筛选

谢先中1，陈晓武2，王永树1

（1．贵州省黔西南民族职业技术学院生物工程系，贵州兴义562400；2．上海海洋大学水产与生命学院，上海201306）

为了找到鬼针草叶蛋白提取最佳生长期和有效提取方法，研究了鬼针草不同生育期和不同方法对叶蛋白提取的影响。结果表明：在鬼针草4个不同生育期中采用直接加热法提取，叶蛋白提取率和沉淀物中粗蛋白含量依次降低，营养生长期（20．2mg／g，61．36%）＞现蕾期（15．9mg／g，61．25%）＞盛花期（14．7mg／g，60．97%）＞结果期（12．1mg／g，54．22%），均以营养生长期为最高。在鬼针草的营养生长期，采用多种方法提取叶蛋白，叶蛋白提取率：酸化加热＋聚乙二醇沉淀法（29．4mg／g）＞酸化加热＋乙醇沉淀法（27．9mg／g）＞酸化加热＋氯化钠法（24．7mg／g）＞酸化加热法（23．1mg／g）＞直接加热法（20．2mg／g）；沉淀物中粗蛋白含量：酸化加热＋乙醇沉淀法（65．35%）＞酸化加热＋氯化钠法（60．72%）＞酸化加热＋聚乙二醇沉淀法（57．13%）。

鬼针草；叶蛋白；不同生育期；不同提取方法；提取率；粗蛋白

鬼针草（Bidens bipinnata L．），又名婆婆针，为菊科鬼针草属一年生草本植物。鬼针草种子多，自播力强，茎倒伏后可生根，早期生长快，对环境的要求极低，产量极高，在全国各地均有分布，已成为侵占力极强的害草之一［1－2］。但研究表明，鬼针草营养丰富、蛋白质、微量元素和维生素的含量高［3－5］；同时鬼针草具有多种药用功效，如清热、解毒、止泻散瘀、消肿，可以用于治疟疾、肝炎、胃病等［6－8］。因此，是一种极具开发潜力的动物饲草资源。然而鬼针草含有苦味质，养殖动物不喜食，使得这一廉价饲料资源未能得到充分利用。鬼针草干物质中粗蛋白含量高达18．9%［5］，若提取其中叶蛋白，将苦味质去除作为饲料添加，将是一条提高鬼针草饲草资源利用的有效途径。当前用于生产浓缩叶蛋白的主要原料有苜蓿、甘薯、苋菜、聚合草、紫云英等［9－14］，而对鬼针草叶蛋白的提取应用的研究尚未见报道。为找到鬼针草叶蛋白提取最佳生长期和有效提取方法，笔者研究鬼针草不同生育期与方法对叶蛋白提取的影响，旨在为鬼针草叶蛋白饲料的开发生产提供参考。

1材料与方法

1．1试验材料

1．1．1植物材料 鬼针草鲜样刈割于在贵州省黔西南民族职业技术学院校园附近草地，为自然形成的单一鬼针草丛，收获地上茎叶。

1．1．2试剂与仪器 试验试剂有氯化钠、聚乙二醇、无水丙酮、无水乙醇、盐酸，试验仪器有CP64电子分析天平（上海洪纪仪器设备有限公司）、恒温水浴锅、组织捣碎机（上海汗诺仪器有限公司）、Starter 3C酸度计（上海洪纪仪器设备有限公司）、烘箱。

1．2植物液制备

鬼针草鲜样剪碎成0．5～1．0cm的小段，混合均匀，电子分析天平称取鲜样100g左右，按原料∶水＝1∶1质量比加入蒸馏水，粉碎打浆3min （10 000r／min），用医用纱布两层叠放在一起压滤，充分挤压，挤出绿色汁液，分别置于锥形瓶中。用蒸馏水将草渣洗涤2次，与第1次压滤汁液混合，蒸馏水每份定容至300mL（料液体积比为1∶3），用胶塞塞住瓶口（防止叶蛋白酶解），备用。

1．3不同生育期鲜草叶蛋白的提取

分别在鬼针草的营养生长期、现蕾期、盛花期、结果期采集样品，按上述制备成汁液。采用直接加热法提取，取100mL鬼针草汁液，70℃水浴加热5min。静置30min，出现沉淀，过滤，在65℃干燥称重，重复3次。

1．4不同方法提取叶蛋白

在鬼针草的营养生长期采集样品，按上述制备成汁液。

取100mL鬼针草汁液，直接70℃水浴加热5min。静置30min，出现沉淀，过滤，在65℃干燥称重，3次重复。

取100mL鬼针草汁液，用1mol／L的盐酸调节汁液pH为4．0，70℃水浴加热5min。静置30min，出现沉淀，过滤，在65℃干燥称重，3次重复。

取100mL鬼针草汁液，用1mol／L的盐酸调节汁液pH为4．0，70℃水浴加热5min。参考相关叶蛋白提取资料［15－18］，分别加入0．3g氯化钠、50mL无水乙醇、0．1g聚乙二醇，静置30min，出现沉淀，过滤，在65℃干燥称重，3次重复。

1．5鬼针草叶蛋白提取率的计算

叶蛋白产量为沉淀干燥后质量乘以3倍，3次重复取均值。提取率按以下公式计算：

叶蛋白提取率＝m沉淀物／m鬼针草鲜样

叶蛋白提取物中的粗蛋白含量使用凯氏定氮法测定。数据用SPSS（Ver．11．5）软件Duncan多重比较检验各组间的差异，P＜0．05表示差异显著。所有的结果均以平均值±标准误（X±SE）表示。

2结果与分析

2．1不同生育期对鬼针草叶蛋白提取率的影响

由表1可见，在营养生长期、现蕾期、盛花期、结果期4个生育期，叶蛋白提取率和沉淀物中粗蛋白含量依次降低，营养生长期（20．2mg／g，61．36%）＞现蕾期（15．9mg／g，61．25%）＞盛花期（14．7mg／g，60．97%）＞结果期（12．1mg／g，54．22%）。叶蛋白提取率和沉淀物中粗蛋白含量均以营养生长期为最高（图示）。结果期叶蛋白提取率和沉淀物中粗蛋白含量显著下降（P＜0．05），与营养生长期相比较分别下降40．09%和11．64%。

表1 不同生育期提取鬼针草的叶蛋白Table 1 Extraction rate of leaf protein fromB．bipinnata

图示 不同生育期的鬼针草叶蛋白提取率Fig． Variation regularity of leaf protein extraction from Bidens bipinnata at different growth stage

2．2不同方法对鬼针草叶蛋白提率的影响

从表2可见，叶蛋白提取率，酸化加热＋聚乙二醇沉淀法（29．4mg／g）＞酸化加热＋乙醇沉淀法（27．9mg／g）＞ 酸化加热 ＋ 氯化钠法（24．7mg／g）＞酸化加热法（23．1mg／g）＞直接加热法（20．2mg／g）。氯化钠、乙醇、聚乙二醇3种沉淀剂均可以提高叶蛋白提取率，酸化加热＋聚乙二醇沉淀法叶蛋白提取率最高，与直接加热相比较提高45．5%，差异极显著（P＜0．01）。而从沉淀物中粗蛋白含量看，酸化加热＋乙醇沉淀法（65．35%）＞酸化加热＋氯化钠法（60．72%）＞酸化加热＋聚乙二醇沉淀法（57．13%）。用乙醇提取沉淀物中粗蛋白含量最高，与直接加热法比较提高6．83% （P＜0．05）。而用聚乙二醇沉淀，虽然提取率提高，但沉淀物中粗蛋白含量却明显降低，与直接加热法比较下降6．60%（P＜0．05）、乙醇沉淀法相比比较下降12．58%（P＜0．05）。

表2 不同方法提取的鬼针草叶蛋白Table 2 Extraction rate of leaf protein fromB．bipinnata with different extraction methods

3结论与讨论

3．1鬼针草叶蛋白提取的最佳生育期

随着植物的生育期变化，植物组织中物质的组成和含量不断变化。豆科类牧草蛋白质含量一般以盛花期为最高［19］，而本试验中叶蛋白提取率和沉淀物中粗蛋白含量均以营养生长期为最高。在现蕾期前，鬼针草物质代谢旺盛，组织幼嫩多汁，蛋白质总含量较高，而现蕾期后，植株趋于老熟，木质素和纤维素含量增加，蛋白质的分离和沉淀更加困难，导致叶蛋白提取率和沉淀中粗蛋白含量均降低，因此营养生长期是鬼针草叶蛋白提取的最佳时期，但营养生长期未能达到鲜草的最大生产量，也可考虑在结果期之前进行提取。

3．2鬼针草叶蛋白提取的最佳方法

沉淀剂的加入是提高叶蛋白提取率的关键，氯化钠、乙醇和聚乙二醇均可有效提高叶蛋白提取率［1518］。聚乙二醇的沉淀作用最好，但沉淀物中粗蛋白含量却明显降低。用乙醇沉淀可以同时提高叶蛋白提取率和沉淀物中粗蛋白含量，但乙醇所用比例较大，本试验乙醇比例为50%，只适合小剂量提取。因此，若对沉淀物粗蛋白含量要求不高，如用于动物饲料添加（其他成分也可利用），可考虑采用聚乙二醇沉淀；如果用于食品添加、医疗等，对沉淀物粗蛋白含量要求高，可考虑采用氯化钠盐析。同时应结合酸化加热以提高叶蛋白提取率。

3．3鬼针草叶蛋白提取条件的优化

本试验研究了鬼针草不同生育期和不同方法对叶蛋白提取的影响，但叶蛋白提取中料水比，提取温度，pH也是影响草叶蛋白提取率，沉淀物中粗蛋白含量的重要因素。其次，本试验中沉淀剂的加入采用参考量。因此有必要对以上条件进行优化，进一步提高鬼针草叶蛋白的提取效果，以促进鬼针草叶蛋白的工业化生产。

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（责任编辑：刘忠丽）

生理生化·耕作栽培

Physiology and Biochemistry·Tillage and Cultivation

Period and Method of Leaf Protein Extraction from Bidens bipinnata

XIE Xianzhong1，CHEN Xiaowu2，WANG Yongshu1
（1．Department of Biological Engineering，Southweast Guizhou Vocational College of Technology for Nationalities，Xingyi，Guizhou 562400；2．College of Fisheries and Life，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The effect of different B．bipinnata growth stage and different extraction methods on leaf protein extraction rate fromB．bipinnata was studied to probe the optimum growth stage of B．bipinnata for extracting its leaf protein and effective extraction method．Results：The leaf protein rate and crude protein content in the sediment at vegetative，budding，full flowering and fruit－bearing stage are 20．2mg／g and 61．36%，15．9mg／g and 61．25，14．7mg／g and 60．97%，and 12．1mg／g and 54．22% respectively by using the direct heating method．When B．bipinnatais at the vegetative stage，the leaf protein extraction rate of the acidification heating＋polyethylene glycol，acidification heating＋ethanol，acidification heating＋NaCl，acidification heating and direct heating method is 29．4mg／g，27．9mg／g，24．7mg／g，23．1mg／g and 20．2mg／g respectively but the crude protein content in the sediment of acidification heating＋ethanol，acidification heating＋NaCl and acidification heating＋polyethylene glycol method is 65．35%，60．72%and 57．13%respectively．

Bidens bipinnata；leaf protein；growth period；extraction method；extraction rate；crude protein

S831．5；Q949．95

A

1001－3601（2016）02－0056－0024－03

2015－07－21；2016－01－13修回

黔西南民族职业技术学院科研资助项目“鬼针草野生饲草资源的综合开发与利用”（201507）

谢先中（1980－），男，讲师，硕士，从事动物营养与疾病防治研究。E－mail：xiexianzhong2008＠163．com