31P-NMR分析湖泊植物和藻类有机磷方法优化及形态研究

冯伟莹,朱元荣,吴丰昌,刘沙沙,张 琛(1.北京师范大学水科学研究院,北京 100875；.中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室,北京 10001)



31P-NMR分析湖泊植物和藻类有机磷方法优化及形态研究

冯伟莹1,2,朱元荣2*,吴丰昌2,刘沙沙1,2,张 琛2(1.北京师范大学水科学研究院,北京 100875；2.中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室,北京 100012)

摘要：应用不同的提取剂和固液比提取湖泊水生植物和藻类中的藻类有机磷(Po),并进一步采用液态核磁共振(31P-NMR)技术分析其组成特征.结果表明:采用0.5mol/L NaOH+25mmol/LEDTA提取剂,并控制固液比为1:60可获得最优的Po提取效果;31P-NMR分析测试过程中,设置延迟时间(D1)为5s,扫描分析时间为15h(约扫描24000次)可获得较好的谱图.通过以上实验方法,分析水生植物和藻类中磷均由正磷酸盐、单酯磷、二酯磷及焦磷酸盐组成,其中Po可分别占总磷(TP)的34.21％～53.36％和31.27％～72.96％.单酯磷是水生植物和藻类Po的主要组分,其平均含量可占Po的92％和83％;二酯磷含量均较少,占TP的0～6.65％;藻类体内焦磷酸盐含量可达水生植物的35倍.

关键词：湖泊；水生植物；藻类；有机磷；31P-NMR

* 责任作者, 助理研究员, zhuyuanrong07@mails.ucas.ac.cn

磷是水生生态系统关键的限制性营养元素之一,过量的磷导致藻类大量生长繁殖,引起水质恶化并危害生态系统安全[1].外源输入和内源循环是导致湖泊水体磷大幅度增加的主要因素.近年来,包括生活污水、工农业生产、土壤径流等过程携带的外源磷输入得到了一定的控制,湖泊内源磷的释放成为引起湖泊水质进一步恶化的关键因素[2-3].沉积物释放是湖泊内源磷污染重要的来源之一[4],但富营养化湖泊中广泛存在的水生植物和藻类,其死亡腐烂分解后的产物可能是湖泊内源磷另一个重要的来源[5-8].例如,太湖东南部草型湖湾(东太湖)水体表面覆盖着高达东太湖总面积70％以上的水生植物,在藻类爆发期间,太湖北部(如梅梁湾)水体表面将会覆盖着大量藻类,且藻类爆发后,产生藻毒素危害生态系统健康,引起一系列环境问题[9].这些水生植物和藻类死亡腐烂分解后,又会对水体造成二次污染,其中磷的释放率远高于碳和氮,半个月内磷的释放量就可高达70％[10].因此,针对湖泊水生植物和藻类来源磷的研究十分重要.有机磷(Po)是水生植物和藻类中磷的重要组成部分,例如滇池水生植物中的Po可以占到其体内总磷(TP)的50％以上[11].另外,已有研究表明Po在水生生态系统的磷循环中扮演重要角色,一些Po组分可通过酶水解转化为生物可利用性活性磷酸盐,进而成为富营养化湖泊蓝藻水华持续暴发的重要磷源[12-14].

由于分析测试方法的限制,对湖泊水生植物和藻类中Po化学结构和形态等的研究还十分有限[11],多数研究一般仅限于有机磷总量的分析.然而,自Newman等[15]1980年将液相31P核磁共振(31P-NMR)技术首次应用土壤提取液中磷的分析,该分析方法很大程度上提高了我们对环境样品中Po组成结构和特征的认识.目前,该分析方法已成为表征环境中Po组成特征的强有力工具[16-18],但是主要集中于土壤[15]、沉积物[19]及腐殖质[20]等物质的研究.因此,本研究选择湖泊具有代表性的水生植物和藻类,优化其Po的提取方法和31P-NMR测定过程中的参数设置,并分析其组成结构特征,这对探索湖泊水生植物和藻类Po在水华爆发过程中所做的贡献以及湖泊内源磷循环及机理具有重要科学意义.

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

典型的水生植物包括狐尾藻、芦苇、轮叶黑藻,均采自太湖.太湖是是中国第三大淡水湖,也是典型的富营养大型浅水湖泊,位于30°55′40″～ 31°32′58″N,119°52′32″～120°36′10″E之间,水面面积为2250km2,湖泊平均水深1.9m,最大水深2.6m[21].近年来,由于人类活动强度的增加,太湖水质不断恶化,水化学环境也发生了重大的变化[9].2007年5月,太湖北部梅梁湾发生大规模水华事件;2008年,太湖北部竺山湾和西部沿岸湖区发生“黑水团”事件;2009～2010年,监测数据表明太湖水华爆发期间产生大量危害动植物健康的藻毒素[22].采集太湖水生植物全株,装入密封袋并冷藏保存;藻类样品包括微囊藻、小球藻、螺旋藻和念珠藻购买于武汉水生生物研究所,其中微囊藻是引起太湖蓝藻水华的主要藻种.所采集样品冷冻干燥后充分研磨,过2mm筛,4℃冷藏保存备用.

1.2 样品中磷基本组成分析

总磷(TP)、无机磷(Pi)和Po的测定应用SMT分析方法[18,23].简述如下:准确称取0.5g水生植物和藻类粉末样品两份(每份3个平行),一份于马弗炉中450℃煅烧3h,样品降至室温后转移至离心管中,加入20mL 3.5mol/L HCl振荡16h,离心分离后磷钼蓝[18,23]分光光度法分析上清液中磷浓度,即TP含量;另一份样品置于离心管中,加入20mL 1mol/L HCl振荡提取16h,离心后测定磷浓度,即Pi含量,最后由TP和Pi相减获得水生植物和藻类Po含量.提取液用0.45μm滤膜过滤留取上清液,取适量提取液稀释后用于提取液TP和提取液Pi分析.提取液TP测定需要首先利用5％过硫酸钾121℃消解30min,提取液中Po为提取液TP和提取液Pi的差值,采用磷钼蓝法[18,23]在Agilent8453紫外分光光度计上测定.

1.3 有机磷提取

表1　不同提取条件的实验设计Table 1 Experiment designing of different extraction conditions

提取剂及提取比例的不同将影响提取液中磷含量、组分以及结构的检测[24].有研究报道,水、NaAs-SD、弱酸、NaHCO3、H2SO4、NaOH、NaOH+EDTA等均可作为环境样品中Po的提取,但在湖泊环境中,多采用NaOH和NaOH+EDTA作为Po的提取剂[16,25],因此本研究选择(0.1,0.25, 0.5)mol/L NaOH+(0,10,25,50)mmol/LEDTA相互组合,1:30和1:60两种提取比例寻找适合湖泊水生植物和藻类Po的最优提取方法,设计编号为A-L(表1).

1.4 液体31P-NMR分析

取0.5g待提样加入一定量的提取剂,室温下振荡提取16h,4℃条件下,8000×g离心30min后留取上清液,冷冻干燥形成粉末,尽快进行31PNMR分析.研究所用核磁共振仪为BRUKER AV400M,瑞士BRUKER公司.31P-NMR分析前,将粉末样品用0.6mL 10mol/LNaOH重新溶解, 以8000×g离心15min,加入0.2mLD2O锁定信号,采用BRUKER标准腔5mm BBO探头,31P的共振频率为161.98Hz,测定温度为20℃,谱峰宽度为5Hz,AQ为0.2102s.另外,NMR参数中延迟时间(D1)的设置分为2,5,15s,分析测试时间相应为12,15,49h,扫描次数均为24000次.参照文献[3,26]确定不同化学位移磷的组成.

2 结果与讨论

2.1 提取剂组成及提取剂比例

如图1,A～C组实验采用1:30提取比例,提取剂分别为0.1,0.25,0.5mol/L NaOH,TP提取率分别为41.79％,48.27％和49.18％,Po提取率分别为34.38％,42.60％和47.62％.表明采用0.25mol/L和0.5mol/LNaOH作为提取剂,TP和Po提取率明显高于0.1mol/L NaOH.张文强等[27]报道pH＞12时,磷组分提取率较高.因此,0.1mol/LNaOH 提取条件下,pH值条件可能未满足最佳提取环境,导致一些磷组分未获得充分的提取.

D～F组实验采用1:60提取比例,提取剂分别为0.1,0.25,0.5mol/LNaOH,则TP提取率除D组(0.1mol/LNaOH)以外,E组和F组TP提取率明显高于B组和C组,分别为69.57％和70.35％.同时,Po提取率也明显高于B和C组,分别为74.56％ 和79.39％.另外,固液比为1:30的提取比例会导致提取液过于黏稠,固液分离效果差,而提取比例为1:60时,提取液既能充分与样品粉末融合又不会过于黏稠且易分离,提取率更高.这表明采用固液比为1:60的提取比例更适合磷组分的提取.因此,湖泊水生植物和藻类Po的提取固液比例确定为1:60.

另外,从B～C组和E～F组实验中,均表明0.5mol/LNaOH提取剂比0.25mol/LNaOH提取磷组分略微偏高.然而,70％左右的提取率并未达到最佳的提取效果.其他环境样品(如土壤、沉积物等[3,25])中Po提取剂一般采用NaOH与EDTA混合液,其中EDTA与金属离子螯合并进一步释放磷,可提高磷的提取效率,且EDTA可与顺磁性金属离子(如Fe和Mn)螯合,提高后续核磁共振分析的分辨率.因此,进一步将0.25mol/L NaOH和0.5mol/L NaOH溶液分别与10,25,50mmol/L EDTA溶液相互组合,利用这6 种NaOH-EDTA提取剂进一步提取并分析提取效果(G～L组,表1).

分析0.25mol/L NaOH与EDTA提取效果:G 组TP和Po提取率分别为73.27％和56.90％;H 组TP提取率略低于G组,为69.98％,但Po提取率略高于G组,为62.80％;I组TP和Po提取率分别为71.97％和80.74％(图1).这表明对于植物和藻类样品而言,添加EDTA后的提取效率比单独使用NaOH作为提取剂的提取效率高,但TP提取率仍不超过75％.由于环境样品提取液中较低的TP含量,将直接影响其他磷组分的表征,间接影响31P-NMR检测的灵敏度[24,28],因此提取剂仍需优化.

进一步分析0.5mol/LNaOH与10,25, 50mmol/LEDTA溶液相互组合(图1):J组TP和Po提取率分别为92.51％和79.51％,TP提取效果较好,Po提取率略低;K组TP和Po提取率为96.16％和90.06％;L组TP和Po提取率为92.30％ 和81.73％.其中K组(0.5mol/LNaOH+25mmol/ LEDTA)对植物和藻类TP和Po的提取效果最优.因此,选择1:60固液提取比,0.5mol/LNaOH+25mmol/LEDTA溶液组合为最优提取剂,提取湖泊水生植物和藻类样品中Po,并进行接下来的31P-NMR分析.

图1　不同提取条件的湖泊水生植物和藻类磷组分提取率Fig.1 Recovery of phosphorus from aquatic plants and algae by different extraction conditions　A～F分别代表提取比例为1:30和1:60时,提取剂分别为0.1,0.25, 0.5mol/L NaOH的TP、Po提取率;G～L分别代表提取比例为1:60时,提取剂分别是(0.25,0.5) mol/L NaOH+(10,25, 50)mmol/L EDTA的TP、Po提取率,详见表1.不同提取条件的提取率差异性极显著,P<0.01

2.231P-NMR分析及其延迟时间的设定

样品31P-NMR分析过程中参数设置,如延迟时间(Delaytimes,D1)、分析测试时间等对于谱图分辨率以及样品中各磷的组分的的定性和定量十分重要[29].不同研究中所采用的参数也存在差异,如Read等[29]选择4.5s的延迟时间对河流与湖泊中磷组成进行了分析,而Zhang等[25]和张文强等[27]采用2s的延迟时间进行巢湖和海河沉积物样品中Po进行了分析.另外,一些环境样品31P-NMR分析过程中还有采用4.32s、8s甚至更长延迟时间[30]. 在同等扫描次数条件下,延迟时间越长则样品分析需要的时间越长.

图2　湖泊藻类磷组分不同延迟时间的液态31P-NMR图谱Fig.2 Solution31P-NMR spectroscopy of phosphorus from algae with different delay times (D1)

以小球藻NaOH-EDTA提取液的31P-NMR分析为例,分别设置延迟时间D1为2s、5s和15s,其他参数设置相同,分析结果如图2和表2.实验结果表明随着测试时间的增长,单酯磷和二酯磷含量及积分比例均降低,正磷酸盐和焦磷酸盐含量及积分比例均上升.D1从2s到5s时,单酯磷含量降低4.71％,二酯磷含量降低不足0.5％,而相应的正磷酸盐和焦磷酸盐分别上升6.36％和1.10％. D1从5s到15s导致分析结果的变化较为明显,其单酯磷含量降低6.08％,二酯磷分解的更为剧烈,从424mg/kg降低到107mg/kg,约有75％二酯磷分解了,相应的正磷酸盐和焦磷酸盐含量分别上升14.55％和7.08％.其中,二酯磷极不稳定,可能随着测试时间的增长而降解为易被生物利用的活性磷组分.因此,为防止Po在分析过程中造成大量的降解,延迟时间不宜过长,测试时间尽量控制在12～15h之间.进一步比较D1=2s和5s的图谱,D1=5s时焦磷酸盐的峰信号更加尖锐些,而D1=2s的焦磷酸盐谱峰相对较宽,D1=2s时单酯磷区域出现6个详细尖峰,而D1=5s时检测出来8个尖峰.因此,从31P-NMR图谱分辨率的角度考虑,对于植物和藻类样品,选择D1=5s时相对较优.综上分析,对湖泊水生植物和藻类样品NaOHEDTA液的31P-NMR分析时,选择D1=5s,测试时间在15h左右.

表2　不同延迟时间的藻类磷组分含量(mg/kg)及积分比例(％)Table 2 Concentration and proportion of phosphorus from algae with different delay times

2.331P-NMR与 NaOH-EDTA提取对水生植物和藻类有机磷总量分析

图3　湖泊水生植物和藻类TP与提取液TP关系Fig.3 Relationships between NaOH-EDTA extractable TP and TP of aquatic plants and algae

利用优化后的方法对湖泊水生植物和藻类中Po进行提取,NaOH-EDTA提取液中的TP和水生植物、藻类中的TP呈线性关系(R=0.997, P<0.01)(图3);另外,31P-NMR检测的总Po含量与传统的磷钼蓝法分析测定的Po含量也呈线性关系(R=0.850,P<0.05).这表明本研究优化后的提取方法结合31P-NMR表征可以反映样品的实际情况,进而探讨湖泊水生植物和藻类中有机磷的分布和变化规律.NaOH-EDTA可提取植物和藻类样品中TP的含量为1184～12419mg/kg,提取率可达82.94％至99.71％,平均为94.14％.研究结果表明采用优化后的提取液、提取比例以及适合的测试参数后,液相31P-NMR技术可以有效且可靠的分析湖泊水生植物和藻类Po,对于后续研究富营养化湖泊水生植物和藻类Po的动力学过程和生物可利用性有重要意义[31].

图4　湖泊水生植物和藻类提取液Po钼酸盐分析结果与31P-NMR分析结果关系Fig.4 Relationships between NaOH-EDTA extractable Poand Pocharacterized by31P-NMR in aquatic plants and algae

2.431P-NMR表征水生植物和藻类有机磷组成特征

采用优化后的提取方法和检测参数,分析湖泊水生植物和藻类磷组分的组成特征表明二者均由正磷酸盐(6×10-6～7×10-6)、单酯磷(4×10-6～ 6×10-6)、二酯磷(-1×10-6～2.5×10-6)、焦磷酸盐(-4×10-6～-5×10-6)组成[16,21,31].水生植物和藻类31P-NMR分析结果中Po以单酯磷为主要组成部分.在环境样品中,磷组分还包括膦酸盐(19×10-6～ 24×10-6)和多聚磷酸盐(-19×10-6～-21×10-6)组分[16,32],但在本研究湖泊水生植物和藻类中未检测到,可能是由于二者含量较少而低于31P-NMR检测限,也可能是在采样以及前处理过程中降解.

图5　湖泊水生植物和藻类磷组分含量和百分比Fig.5 Contents (a) and proportions (b) of individual P compounds in aquatic plants and algae samples detected by31P-NMR　图a:磷组分含量,图b:磷组分百分比,1-3样品为水生植物(分别为狐尾藻,芦苇,轮叶黑藻);4-7样品为藻类(分别为微囊藻,小球藻,螺旋藻,念珠藻)

水生植物Pi占TP的46.64％～65.79％,Po可达TP总量的34.21％～53.36％;藻类Pi占TP的27.04％～68.73％,而Po甚至可达TP总量的31.27％～72.96％(图5).其中,水生植物中单酯磷占TP的31.05％～49.74％,平均含量占Po的92％;藻类单酯磷占TP的19.1％～56.27％,除念珠藻外,平均含量高达Po的83％.因此,单酯磷是水生植物和藻类中Po的主要组分.当然,少量单酯磷也可能在分析过程中发生降解.例如,由于D1=15s时,测试时间较长(49h),导致了6.08％的单酯磷分解(图2和表2).值得注意的是,一些二酯磷,例如磷酸酯类易在分析过程中降解为α-甘油酯、β-甘油酯[27];RNA易降解为核苷酸等,由于二酯磷极易降解的特性,在样品采集、前处理及长时间分析测试过程均可能造成该磷组分的分解.因此,一般来说,用31P-NMR检测到的二酯磷含量比环境样品中的实际含量偏低[17,33].焦磷酸盐占水生植物TP的0.91％～2.08％,而藻类除微囊藻以外,其他3种藻类平均焦磷酸盐占TP接近18％,平均含量为1328mg/kg(图5).其中,藻类焦磷酸盐含量约为水生植物的35倍.已有研究表明[27,29],焦磷酸盐具有较高的活性,可以被水生生物等直接吸收利用,是蓝藻水华爆发的潜在二次磷来源.

3 结论

3.1 采用0.5mol/LNaOH+25mmol/L EDTA提取剂并控制固液比1:60提取湖泊水生植物和藻类中磷,获得样品中TP与Po提取率可高达90％以上;进一步采用液体31P-NMR分析其中Po时,选择设置延迟时间(D1)为5s,扫描分析时间为15h左右(扫描次数为24000次)可获得较优的31P-NMR谱图,较优的提取方法和参数设置条件为进一步分析湖泊水生植物和藻类Po组成结构特征及其生物地球化学行为提供科学依据.

3.2 NaOH-EDTA提取结合31P-NRM分析表明湖泊水生植物和藻类中磷由正磷酸盐、单酯磷、二酯磷以及焦磷酸盐组成,单酯磷均为水生植物和藻类中Po重要组分,其平均含量分别占Po的92％和83％,易降解的二酯磷在水生植物和藻类均较少,占TP的0～6.65％.另外,藻类体内焦磷酸盐含量约为水生植物的35倍.湖泊水生植物和藻类来源的有机磷是蓝藻水华爆发后潜在的二次营养盐.

参考文献：

[1] Baldwin D S. Organic phosphorus in the aquatic environment [J]. Environmental Chemistry, 2013,10(6):439-454.

[2] Zhu Y, Wu F, He Z, et al.Characterization of organic phosphorus in lake sediments by sequential fractionation and enzymatic hydrolysis [J]. Environ. Sci. Technol., 2013,47(14):7679-7687.

[3] 黎 睿,王圣瑞,肖尚斌,等.长江中下游与云南高原湖泊沉积物磷形态及内源磷负荷 [J]. 中国环境科学, 2015,35(6):1831-1839.

[4] Reitzel K, Ahlgren J, Gogoll A, Rydin E.Effects of aluminum treatment on phosphorus, carbon, and nitrogen distribution in lakesediment: a 31P NMR study [J]. Water research, 2006,40(4):647-654.

[5] 李振国,王国祥,马久远,等.马来眼子菜群丛对太湖不同湖区沉积物磷形态的影响 [J]. 中国环境科学, 2014,34(7):1872-1877.

[6] 叶 春,王 博,李春华,等.沉水植物黑藻腐解过程中营养盐释放过程 [J]. 中国环境科学, 2014,34(10):2653-2659.

[7] 王 智,张志勇,张君倩,等.两种水生植物对滇池草海富营养化水体水质的影响 [J]. 中国环境科学, 2013,33(2):328-335.

[8] 向速林,朱梦圆,朱广伟,等.太湖东部湖湾大型水生植物分布对水质的影响 [J]. 中国环境科学, 2014,34(11):2881-2887.

[9] Tao Y, Yuan Z, Fengchang W, Wei M. Six-Decade Change in Water Chemistry of Large Freshwater Lake Taihu, China [J]. Environmental Science and Technology, 2013,47(16):9093-9101.

[10] 李文朝,陈开宁,吴庆龙,等.东太湖水生植物生物质腐烂分解实验 [J]. 湖泊科学, 2001,13(4):331-336.

[11] Qu X, Xie L, Lin Y, et al. Quantitative and qualitative characteristics of dissolved organic matter from eight dominant aquatic macrophytes in Lake Dianchi, China [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2013,20(10):7413-7423.

[12] Da-Peng L, Yong H.Sedimentary phosphorus fractions and bioavailability as influenced by repeated sediment resuspension [J]. Ecological Engineering, 2010,36(7):958-962.

[13] Monbet P, McKelvie I D, Worsfold P J. Dissolved organic phosphorus speciation in the waters of the Tamar estuary (SW England) [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 2009,73(4): 1027-1038.

[14] Wang J, Pant H K. Identification of organic phosphorus compounds in the Bronx River bed sediments by phosphorus-31nuclear magnetic resonance spectroscopy [J]. Environmental Monitoring and Assessment, 2010,171(1-4):309-319.

[15] Newman R, Tate K. Soil phosphorus characterisation by 31P nuclear magnetic resonance [J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 1980,11(9):835-842.

[16] Cade-Menun B J. Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy [J]. Talanta, 2005,66(2):359-371.

[17] Cade-Menun B J.Improved peak identification in 31P-NMR spectra of environmental samples with a standardized method and peak library [J]. Geoderma, 2015,257-258:102-114.

[18] Zhu Y, Wu F, He Z, et al. Influence of Natural Organic Matter on the Bioavailability and Preservation of Organic Phosphorus in Lake Sediments [J]. Chemical Geology, 2015,397:51-60.

[19] Ahlgren J, Reitzel K, Danielsson R, et al. Biogenic phosphorus in oligotrophic mountain lake sediments: Differences in composition measured with NMR spectroscopy [J]. Water Research, 2006, 40(20):3705-3712.

[20] He Z, Olk D C, Cade-Menun B J. Forms and lability of phosphorus in humic acid fractions of Hord silt loam soil [J]. Soil Science Society of America Journal, 2011,75(5):1712-1722.

[21] Bai X, Ding S, Fan C, et al. Organic phosphorus species in surface sediments of a large, shallow, eutrophic lake, Lake Taihu, China [J]. Environmental Pollution, 2009,157(8):2507-2513.

[22] Otten T, Xu H, Qin B, et al. Spatiotemporal patterns and ecophysiology of toxigenic Microcystis blooms in Lake Taihu, China: implications for water quality management [J]. Environmental Science andTechnology, 2012,46(6):3480-3488.

[23] Zhu Y, Zhang R, Wu F, et al. Phosphorus fractions and bioavailability in relation to particle size characteristics in sediments from Lake Hongfeng, Southwest China [J]. Environmental Earth Sciences, 2013,68(4):1041-1052.

[24] 陆 瑾,王海文,郝 红,等.31P-NMR分析湿地沉积物有机磷的方法优化 [J]. 光谱学与光谱分析, 2013,33(11):3157-3161.

[25] Zhang W, Tang W, Zhang H, et al. Characterization of biogenic phosphorus in sediments from the multi-polluted Haihe River, China, using phosphorus fractionation and 31P-NMR [J]. Ecological Engineering, 2014,71:520-526.

[26] He Z, Honeycutt C W, Griffin T S, et al. Phosphorus forms in conventional and organic dairy manure identified by solution and solid state P-31NMR spectroscopy [J]. Journal of Environmental Quality, 2009,38(5):1909-1918.

[27] 张文强,单保庆,张 洪,等.基于液相31P核磁共振技术的河流沉积物有机磷提取剂选择研究 [J]. 环境科学学报, 2014,34(1):194-201.

[28] 白秀玲,周云凯,李 斌,等.利用31P核磁共振技术优化太湖沉积物有机磷的化学提取方法 [J]. 环境科学学报, 2011,31(5):996-1003.

[29] Read E K, Ivancic M, Hanson P, et al. Phosphorus speciation in a eutrophic lake by 31P NMR spectroscopy [J]. Water Research, 2014,62:229-240.

[30] Giles C D, Lee L G, Cade-Menun B J, et al. Characterization of Organic Phosphorus Form and Bioavailability in Lake Sediments using P Nuclear Magnetic Resonance and Enzymatic Hydrolysis [J]. Journal of Environmental Quality, 2015,44(3):882-894.

[31] Turner B L, Mahieu N, Condron L M. Phosphorus-31nuclear magnetic resonance spectral assignments of phosphorus compounds in soil NaOH–EDTA extracts [J]. Soil Science Society of America Journal, 2003,67(2):497-510.

[32] Johnson N R, Hill J E. Phosphorus species composition of poultry manure-amended soil using high-throughput enzymatic hydrolysis [J]. Soil Science Society of America Journal, 2010, 74(5):1786-1791.

[33] Pinchuk G E, Ammons C, Culley D E, et al. Utilization of DNA as a sole source of phosphorus, carbon, and energy by Shewanella spp.: ecological and physiological implications for dissimilatory metal reduction [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008,74(4):1198-1208.

Optimization of extraction and parameters for31P-NMR analysis of organic phosphorus extracted from aquatic plants and algae.

FENG Wei-ying1,2, ZHU Yuan-rong2*, WU Feng-chang2, LIU Sha-sha1,2, ZHANG Chen2(1.College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China；2.State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China). China Environmental Science, 2016,36(2)：532～568

Abstract：Characterization of organic phosphorus (Po) from aquatic plants and algae by solution31P-Nuclear Magnetic Resonance (31P-NMR) is important to understand its biogeochemical cycling in lakes. Methods of extraction and selection of parameters for NMR characterization and quantification of Po critical. Various extractants and radio of sample to extractants were applied for 31P-NMR. A mixture of 0.5mol/L NaOH-25m mol/L EDTA with a ratio of sample to extractant of 1:60 was the optimal extraction of Po from aquatic plants and algae. When the extract was analyzed by use of 31P-NMR, the delay time (D1) and scanning time were set to 5s and 15h, respectively, which resulted in approximately 24,000 scans. Based on how Samples were extracted and results of 31P-NMR analysis, P in aquatic plants and algae included orthophosphates, orthophosphate monoesters, orthophosphate diesters and pyrophosphate, of which Po accounted for 34％～53％ and 31％～73％ respectively. Orthophosphate monoester was the predominant constituent of Po, which accounted for 92 and 83％ of plants and algae, respectively. The proportion of orthophosphate diesters was small in aquatic plants and algae and accounted for only 0～6.65％ of the TP. The content of pyrophosphate in algae was approximately 35-fold greater than that in aquatic plants.

Key words：lake；aquatic plants；algae；organic phosphorus；31P-NMR

作者简介：冯伟莹(1986-),女,内蒙古赤峰人,北京师范大学与中国环境科学研究院联合培养博士研究生,研究方向为湖泊环境污染与治理.发表论文9篇.

基金项目：国家自然科学基金资助项目(41403094,41430743, 41261140337)

收稿日期：2015-07-15

中图分类号：X171.5

文献标识码：A

文章编号：1000-6923(2016)02-0562-07