姜黄素介导的光动力冷杀菌方法对牡蛎杀菌的效果研究

曹斌斌，武 娟，许川山，梁荣能，李兆杰　，王玉明，薛 勇，薛长湖，唐庆娟,*（.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 66003；.香港中文大学中医学院，香港 999077）



姜黄素介导的光动力冷杀菌方法对牡蛎杀菌的效果研究

曹斌斌1，武 娟1，许川山2，梁荣能2，李兆杰1，王玉明1，薛 勇1，薛长湖1，唐庆娟1,*
（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；2.香港中文大学中医学院，香港 999077）

摘 要：通过光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）对牡蛎肉匀浆及牡蛎肠道中的细菌进行杀灭处理，探究PDT可否杀灭牡蛎中的细菌。结果表明，以姜黄素为光敏剂的光动力冷杀菌处理对牡蛎中细菌具有非常好的灭活效果，3、6 h光敏剂富集组对牡蛎的杀菌率可达90%以上。同时该方法处理简便，且具有广谱杀菌特性。

关键词：光动力方法；冷杀菌；牡蛎；姜黄素；菌落总数

引文格式：

曹斌斌,武娟,许川山,等.姜黄素介导的光动力冷杀菌方法对牡蛎杀菌的效果研究[J].食品科学,2016,37(5):46-49.

CAO Binbin,WU Juan,XU Chuanshan,et al.Inactivation effect of curcumin-mediated photodynamic non-thermal sterilization on bacteria in oysters[J].Food Science,2016,37(5):46-49.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605009.http://www.spkx.net.cn

我国牡蛎多为近海养殖，水体极易被污染，牡蛎在滤食水中食物的同时大量富集养殖水域中各类微生物，导致牡蛎卫生质量较差、货架期较短，容易引发食品安全问题[1]。传统的热力杀菌方法虽然可以有效灭活微生物，但所需的高温会导致食品产生色泽、风味和营养物质的改变和损失[2]，导致加工后的牡蛎难以满足消费者生食贝类的饮食要求。所以，各类冷杀菌方法常被用于牡蛎加工保鲜中，目前已应用的冷杀菌技术主要有涂膜保鲜[3-5]、冻藏保鲜[6-7]、臭氧杀菌保鲜[8]、超高压杀菌保鲜[9]等技术。但是，这些技术或杀菌效果不理想，或导致牡蛎营养丢失严重，或成本太高。因此，开发一种能有效灭活微生物又能保持牡蛎的营养和品质，成本低廉的新型冷杀菌技术是牡蛎加工行业迫切的要求[10]。

光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）亦称光化学疗法或光辐射疗法（photodynamic inactivation，PDI），是一种可选择性灭活恶性肿瘤细胞和致病性微生物（包括细菌、真菌和病毒）的新方法。在特定波长的光源照射激发下，无毒的光敏剂吸收光子的能量后跃迁到激发态，激发态的光敏剂将能量传递给周围的氧，产生单态氧和一些活性氧物质。这些活性氧具有强氧化作用，能够破坏细胞大分子物质的结构导致细胞受损乃至死亡，从而达到灭活恶性肿瘤细胞和致病微生物的目的[11-13]。目前，光动力疗法已经在医学领域表现出明显的抗肿瘤[14-15]、抗细菌[16]、抗病毒[17]等效果，被应用于癌症[18]及血液制品[19]的消毒中，但是尚未见该技术在水产品加工领域应用的报道。

姜黄素是目前世界上销量最大的天然食用色素之一，属于天然植物提取物，原料来源广，成本低，安全无毒、无污染。研究表明，姜黄素具有光敏活性，对红色毛癣菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等有强烈的抑制作用，可以治疗皮肤病[20-23]。江园等[12,22]报道以姜黄素为光敏剂的光动力方法可以有效诱导癌细胞凋亡，并且具有较好的杀菌效果，其中激发光为普通蓝光光源（波长范围420～480 nm）。本实验采用姜黄素为光敏剂的光动力方法处理牡蛎，探讨该方法对牡蛎中细菌的灭活效果，为光动力杀菌法应用于水产品加工领域提供参考。

1　材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

牡蛎购买于青岛市团岛农贸市场，鲜活低温条件运回实验室，无菌水冲洗干净备用。

姜黄素（curcumin，食品级，纯度＞95%） 陕西慈缘生物科技有限公司；LB琼脂培养基 北京陆桥技术有限责任公司。

电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；JYL-C012九阳料理机 九阳股份有限公司；LED蓝光光源（波长范围420～480 nm）由香港中文大学许川山课题组提供。

1.2方法

1.2.1光动力对牡蛎肠道细菌的灭活

将新鲜的牡蛎洗干净后在无菌条件下开壳，切取牡蛎消化道部分，用无菌水稀释100 倍后匀浆。在无菌的6孔板各孔中加入2 mL匀浆液，按照处理条件不同将匀浆液分成4 组，分别为：对照组（无光照、无姜黄素）、单纯光照组（有光照、无姜黄素，使用自制光源照射60 s，根据光源功率推算得到光能量密度为3.6 J/cm2，后文中均使用光能量密度来描述光照强度）、单纯光敏剂组（添加10 μmol/L的姜黄素，避光）、光动力实验组（添加10 μmol/L姜黄素，光能量密度为3.6 J/cm2）。每组设置2 个平行。无菌条件下，参照GB 4789.3—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》要求，分别取匀浆液1 mL接种到LB固体培养基中，25 ℃恒温培养箱中培养48 h，计数细菌总数。其中，杀菌率按下式计算。

1.2.2光动力冷杀菌技术条件的选取

本课题组前期预实验发现影响光动力方法对牡蛎肉杀菌效果的主要因素是光能量密度和光敏剂浓度。在此基础上，按照1.2.1节所述步骤处理牡蛎，获得其消化道部分的匀浆稀释液，以此来探究不同姜黄素浓度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）和光能量密度（1.8、3.6、5.4 J/cm2）对杀菌效果的影响。

1.2.3光动力对新鲜半壳牡蛎中细菌的灭活

将新鲜、洗净的活牡蛎分成4 组，对照组置于人工海水中，其余3 组置于含有姜黄素10 μmol/L的人工海水中，分别暂养3、6、12 h，其中m（贝类）∶m（海水）= 1∶4。将富集了姜黄素的牡蛎在无菌条件下开壳，给予5.4 J/cm2的光能量密度。各组取适量实验前后的姜黄素人工海水，用720型分光光度计测定446 nm波长处的光密度（OD）值，计算姜黄素的富集量，暂养3、6、12 h后姜黄素富集量按下式计算。

在无菌条件下，将4 组牡蛎肉进行匀浆并分别以体积比1∶100添加无菌水，将稀释液涂布到LB固体培养基上，设置阴性对照为无菌水，涂布后培养基置于25 ℃恒温培养箱中培养48 h，计数菌落总数。每组进行3 个平行实验。

1.2.4牡蛎中细菌的纯化培养和16S rRNA基因测序

为了验证光动力杀菌方法是否在牡蛎杀菌中也具有非特异性杀菌特性，挑取对照组培养基中生长但光动力实验组培养基中已被杀灭或数量大量减少的细菌菌落，接种至LB液体培养基后，置于25 ℃振荡培养箱中培养24 h。取菌液在LB固体培养基表面进行划线培养，挑取单菌落后在LB肉汤液体培养基中扩大化培养，取5 mL菌液在4 000 r/min条件下离心5 min，弃上清液得菌体，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行细菌16S rRNA测序。

1.3数据统计分析

采用SPSS 18.0软件，对实验数据进行方差分析（analysis of variance，ANOVA）；显著性检验采用t检验。

2　结果与分析

2.1光动力对牡蛎肠道细菌的灭活效果

由图1可知，单纯光照组与对照组菌落数没有显著变化；由于姜黄素本身就具有一定的杀菌活性，所以只添加光敏剂具有一定的杀菌效果，杀菌率为44.27%，与对照组相比差异极显著；光动力实验组中杀菌率达到98.85%，与对照组相比差异极显著。由此，本实验证实，光动力方法对牡蛎肠道细菌具有较好的杀菌效果。

图1　光动力对牡蛎肠道细菌灭活效果Fig.1 Inactivation of PDT on intestinal bacteria in oysters

2.2光动力冷杀菌条件选取

图2　不同姜黄素浓度和光能量密度对杀菌效果的影响Fig.2 Effect of different concentrations of curcumin and different light energy densities on sterilization efficiency

由图2可知，在光能量密度为1.8 J/cm2时，低光敏剂浓度的实验组杀菌效果不佳，2 个高光敏剂浓度的实验组杀菌效果较好且无明显差异（P＞0.05）；在光能量密度为3.6 J/cm2和5.4 J/cm2时，光敏剂浓度为10 μmol/L实验组杀菌效果极好，且相比于其他2 个光敏剂组均具有明显差异（P＜0.01），而光敏剂浓度为1.0、0.1 μmol/L时杀菌效果不佳。所以，当光敏剂浓度为10 μmol/L、光能量密度为3.6～5.4 J/cm2时，光动力方法可以有效杀灭牡蛎匀浆中细菌。为了节约能源，本课题组后续实验中均设置光能量密度为3.6 J/cm2。

2.3光动力对新鲜半壳牡蛎中细菌的灭活效果

表1　姜黄素富集时间对新鲜半壳牡蛎中细菌的杀菌效果Table 1 Sterilization of different bioaccumulation time of curcumin on bacteria in half-shell oysters

将光敏剂按照不同富集时间进行分组，分为0、3、6、12 h共4 组。由表1可知，在3、6 h后光敏剂基本被完全富集，12 h长时间富集后光敏剂富集水平基本无变化，无显著性差异（P＞0.05）；相比于0 h光敏剂富集组，3、6 h光敏剂富集组对牡蛎杀菌率均为90%以上，差异极显著（P＜0.01）；然而，12 h富集组的杀菌率仅为56.31%，相比于0 h光敏剂富集组，仍具有极显著差异（P＜0.01），推测12 h组杀菌率低的原因可能是长时间的富集过程中光敏剂降解，并伴有细菌增殖过程，确切原因有待进一步探究。

2.4光动力冷杀菌技术对牡蛎中特定细菌的抑制效果

在探究光动力方法对牡蛎中细菌灭活效果实验中，通过观察各组培养基，发现各个实验组培养基中圆形菌落相比对照组数量减少，而一些黄色菌落、橙色菌落均完全消失。因此挑取这些具有明显形态差异的菌落进行纯化培养，扩增细菌16S rRNA基因后进行测序，以鉴别这些菌落种属，验证光动力杀菌在牡蛎杀菌中是否具有非特异性。将测序结果与GenBank中序列进行比对，得到菌落在国家国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中的基因序号，其结果见表2。经过多次实验观察发现，嗜冷杆菌灭活效果较好但是仍有菌落检出；迪茨氏菌、枯草芽孢杆菌未检出。这3 类菌落既有革兰氏阴性菌又有革兰氏阳性菌，其中嗜冷杆菌并不属于致病菌，并且本课题组也已验证光动力方法对牡蛎中的大肠杆菌和副溶血性弧菌也具有较好的杀灭效果，这都说明光动力方法可以广泛地杀灭牡蛎体内细菌，具有很好的应用价值。

表2　光动力冷杀菌技术对牡蛎中特定细菌抑制效果Table 2 Photodynamic sterilization of particular bacteria in oysters

3　讨 论

目前，常用于牡蛎保藏的热力学杀菌方法、冻藏方法，对牡蛎风味及解冻后品质影响较大，市场亟需寻找能最大限度地保留牡蛎色、香、味及营养成分的新型保鲜冷杀菌方法。现已应用于牡蛎保鲜杀菌的冷杀菌技术存在诸多问题：涂膜保鲜技术杀菌效果不佳；保鲜剂结合微冻保鲜等方法易引起牡蛎汁液流失；冻藏保鲜可延长保质期，但是容易造成牡蛎组织结构的破坏、脂肪氧化、色泽变化，解冻后营养流失严重；气调保鲜效果不佳，基本无杀菌效果；臭氧保鲜杀菌技术中臭氧的制备和存储复杂，生产成本高；超高压处理保鲜对牡蛎的品质影响很小，能保持牡蛎原有的味道，但是设备昂贵、生产成本高[24]。

光动力疗法已经广泛应用于皮肤病等疾病的治疗，也已被证明可以抑制癌细胞生长，对细胞、细菌等都有较好的灭活或抑制效果，但暂无应用于水产品加工的报道[25-28]。本研究成功地将光动力方法用于牡蛎中细菌的灭活，取得了较好的效果，证实了以姜黄素为光敏剂介导的光动力冷杀菌方法可以有效灭活牡蛎肠道及牡蛎体内的细菌，其杀菌率达到90%以上，其中嗜冷杆菌、速生嗜冷杆菌被部分灭活，迪茨氏菌、枯草芽孢杆菌被完全灭活。光动力杀菌方法属于冷杀菌，整个过程操作简单，极好地保持了牡蛎的感官品质，可以满足消费者生食牡蛎的需求，具有很高的推广应用价值。

光动力冷杀菌方法相比于目前已有的各类牡蛎杀菌方法，具有低成本、安全、简便、无毒无害、非特异性杀菌等一系列优点，并且经过7 名专业感官评定小组成员评定后（实验结果略），处理后牡蛎的感官品质得到了很好的保持。光动力杀菌处理有效地杀灭了牡蛎中细菌，且经处理的牡蛎能在外观和口感上保持原有品质，十分契合消费者对牡蛎生食的饮食需求，是一种很好的牡蛎冷杀菌方法。

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Inactivation Effect of Curcumin-Mediated Photodynamic Non-Thermal Sterilization on Bacteria in Oysters

CAO Binbin1,WU Juan1,XU Chuanshan2,LEUNG Albert Wing nang2,LI Zhaojie1,WANG Yuming1,XUE Yong1,XUE Changhu1,TANG Qingjuan1,*
(1.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China; 2.School of Chinese Medicine,The Chinese University of Hong Kong,Hong Kong 999077,China)

Abstract:This study aims to explore whether photodynamic therapy(PDT)can inactivate bacteria in oysters.The results showed that photodynamic inactivation technology using curcumin as the photosensitizer had very good inactivation effect on bacteria in oysters.This technology has the characteristics of high sterilization efficiency(exceeding 90%),broad antibacterial spectrum,and easy operation.This study suggests that photodynamic non-thermal sterilization technology has the potential to be applied in the oyster processing industry in the future.

Key words:photodynamic method; non-thermal sterilization; oyster; curcumin; total plate count

中图分类号：TS254.4

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2016）05-0046-04

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605009 10.7506/spkx1002-6630-201605009.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：唐庆娟（1971—），女，副教授，博士，研究方向为食品科学。E-mail：tangqingjuan@ouc.edu.cn

作者简介：曹斌斌（1991—），男，硕士研究生，研究方向为食品科学。E-mail：cbbhaida@163.com

基金项目：山东省重点研发计划项目（2015GSF115030）；“泰山学者”建设工程专项

收稿日期：2015-04-08