不同U87细胞数量对裸鼠原位恶性胶质瘤模型构建的影响

唐焕焕，沈晓燕，段小群，苑博，张艳群，张嫦丽，吕良

(1 桂林医学院药学院，广西桂林541001；2复旦大学药学院)



不同U87细胞数量对裸鼠原位恶性胶质瘤模型构建的影响

唐焕焕1，沈晓燕2，段小群1，苑博1，张艳群1，张嫦丽1，吕良1

(1 桂林医学院药学院，广西桂林541001；2复旦大学药学院)

摘要：目的观察不同数量的人恶性胶质瘤U87细胞对裸鼠原位恶性胶质瘤模型构建的影响。方法将20只裸鼠随机分成A、B、C、D组各5只，于右侧纹状体分别注射0、0.05×105、0.2×105、1×105/μL的U87细胞悬液5 μL。接种前及接种后4周称取体质量，接种4周后取脑组织测量肿瘤体积，并行脑组织病理检查。结果接种后4周，D组体质量较A组降低(P<0.05)，其他组间无统计学意义。A组无肿瘤形成，脑组织病理检查未见异常；B、C、D组均可见肿瘤组织，细胞核中Ki-67蛋白表达强阳性；肿瘤体积分别为(1.57 ±0.09)、(4.25 ±1.15)、(16.32 ±0.41)mm3，组间比较，P均<0.05。结论 U87细胞颅内接种可构建原位恶性胶质瘤模型，且接种细胞数量越多建模效果越好。

关键词：颅脑肿瘤；胶质瘤；U87细胞；动物模型

恶性神经胶质瘤是常见的中枢神经系统原发性肿瘤[1]，恶性程度极高，发病迅速，病死率高[2]，传统治疗方法复发率高[3]。因此，建立一个成熟稳定的恶性神经胶质瘤动物模型，可为进一步研究胶质瘤的发病机制及药效学评价奠定实验基础。2014年10月～2015年3月，我们以不同浓度的人恶性胶质瘤细胞系U87接种裸鼠，为诊治恶性神经胶质瘤的相关研究提供有用的动物模型。

1材料与方法

1.1材料裸鼠20只，雌雄不限，5周龄，体质量(20±2)g，购自湖南斯莱克公司； U87细胞购于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心，DMEM培养基、青霉素链霉素双抗(PS)、FBS、TrypLE(Gibco公司)，Envision免疫组化检测试剂(Dako公司)，微量注射泵购于KDS公司，抗人Ki-67抗体(1∶200)购于BD公司，无菌骨蜡(上海三友公司)，小动物脑立体定位仪(深圳瑞沃德公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养将U87细胞接种于细胞培养皿，用含10% FBS和1% PS的DMEM高糖培养液置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每3～5 d更换培养液1次。待细胞融合率>80%时，按1∶5的比例传代。

1.2.2分组与造模将裸鼠于SPF环境中适应性饲养1周后，随机分成4组各5只。取对数生长期的U87细胞，用TrypLE消化后离心，弃上清；PBS重悬沉淀，配成0、0.05×105、0.2×105、1×105/μL的细胞悬液。同时，将裸鼠麻醉后固定在小动物脑立体定位仪上，夹好鼻夹，插入耳杆；作头顶部正中切口，剥离骨膜，暴露出前囟；注射针头对准前囟点，将前后坐标(AP)和左右坐标(ML)调零。调节好AP和ML坐标后，将针尖移至触碰颅骨，最后将深度坐标(DV)调零，裸鼠右侧纹状体的注射坐标为AP -1 mm、ML -1.8 mm、DV -3.5 mm。A、B、C、D组分别应用微量注射针直接注射0、0.05×105、0.2×105、1×105/μL的细胞悬液5 μL(细胞数分别为0、0.25×105、1×105、5×105个)，速度设为1 μL/min。注射后留针3 min，缓慢出针，无菌骨蜡封闭骨孔，缝合皮肤，消毒伤口。

1.2.3体质量检查分别于接种前、接种后4周，称取裸鼠体质量。

1.2.4肿瘤组织病理检查接种4周后麻醉动物，在裸鼠心脏左心室插管灌注冰冷的PBS，取全脑；测量脑肿瘤体积[4]后置于4%甲醛溶液中固定24 h；常规石蜡包埋，4 μm切片；行HE染色，观察病理变化。免疫组化Envision两步法检查Ki-67，按试剂盒说明操作。

2结果

2.1各组体质量比较见表1。

表1　各组体质量比较

注：与A组比较，*P<0.05。

2.2各组肿瘤组织病理检查结果A组无肿瘤形成，脑组织病理检查未见异常；其余组均有成瘤，B、C、D组肿瘤体积分别为(1.57±0.09)、(4.25±1.15)、(16.32±0.41)mm3，组间比较，P均<0.05。肿瘤组织与正常组织边界明显，染色较正常脑组织颜色深，呈圆形或椭圆形，细胞排列密集，大部分细胞核中Ki-67蛋白表达强阳性。

3讨论

目前，已相继建立了多种胶质瘤模型，包括同种异位模型[5,6]、同种原位模型[7,8]、异种异位模型[9]和异种原位模型[10,11]等。其中，裸鼠皮下移植瘤模型操作简单，便于观察，但皮下种植的胶质瘤生长到第15天左右会停止生长或生长缓慢[12]，且皮下瘤无法评价药物是否可以通过血脑屏障。因此，原位胶质瘤更能真实反映肿瘤在颅内生长的真实状态，更具研究价值。原位移植的建立较为复杂，存在观察困难的问题。我们利用小动物脑立体定向仪定向操作，使定位准确。有研究表明，进样速度会影响肿瘤的形态[13]。因此，我们使用了可以调控进样速度的微量进样泵，严格控制进样速度。

本研究结果显示，接种后4周，D组体质量较A组降低，其他各组间比较无统计学意义。A组无肿瘤形成，脑组织病理检查未见异常；B、C、D组均可见肿瘤组织细胞，细胞核中Ki-67蛋白表达强阳性；肿瘤体积与细胞数量成正比，其中以5×105个接种数为最佳。这与国外研究报道得到的结果相近似[14,15]。本研究成功构建原位恶性胶质瘤模型，对于同行具有借鉴意义，为下一步研究工作的开展打下了坚实的基础。

参考文献：

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(收稿日期：2015-10-22)

中图分类号：739.41

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)10-0029-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.011

通信作者：吕良(E-mail: luliang998@163.com)

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81460619)；广西自然科学青年基金资助项目(2015 GXNSFBA 139178)。