免疫系统人源化小鼠的构建及其应用进展①

王岩石　田志刚

(中国科学技术大学免疫学研究所,合肥230027)



·专家述评·

免疫系统人源化小鼠的构建及其应用进展①

王岩石田志刚

(中国科学技术大学免疫学研究所,合肥230027)

[摘要]人源化小鼠模型经历了近四十年的发展，已经从难以实现重建到日趋成熟，随着受者小鼠的免疫缺陷程度逐渐增加，人源化免疫系统的重建水平也得以提高。不仅受者小鼠的基因背景对重建水平至关重要，多种细胞因子补给策略也再一次实现了突破。伴随模型构建的逐渐完善，人源化小鼠已经在诸如造血功能、感染性疾病、自身免疫病以及肿瘤学研究等多领域显现出其独特的用于体内研究人类生理及病理的优势。人源免疫细胞发育过程均在小鼠体内完成，受到小鼠基质细胞的选择和教育，但是由于种属特异性的存在，使得人源化免疫系统往往在功能上受损，从人源化小鼠体内得到的结论还不能完全反映出人体内的情况。因此，仍需进一步完善人源化小鼠模型的构建，为临床治疗前的研究提供有力的工具。

[关键词]免疫系统；人源化小鼠；感染性疾病；肿瘤；造血；自身免疫病

王岩石(1987年-)，男，在读博士，2010年毕业于南开大学生物科学专业，获得理学学士学位，同年推荐免试进入中国科学技术大学生命科学学院攻读硕士学位，师从田志刚教授，2012年起攻读博士学位，主要从事免疫系统人源化小鼠模型方面的研究。

田志刚 (1956年-)，男，中国科学技术大学生命科学学院教授、博士生导师，现任中国科技大学生命科学学院免疫学研究所所长。中国免疫学会理事长，中国免疫学会英文会刊(Cell Mol Immunol)执行主编，中文会刊《中国免疫学杂志》主编。2001年国家杰出青年基金获得者、2007年教育部创新团队负责人、2008 和 2011 年国家基金委《天然免疫与重大疾病发生发展》创新群体负责人。2008年获国家自然科学二等奖(首位)、2011年获国家科技进步二等奖(第二位)。2015年获何梁何利奖。主要从事天然免疫和肝脏免疫学研究，以通讯作者在Cell、Nat Immunol、Immunity、J Clin Invest、J Exp Med、PNAS、Nat Commun、Gastroenterology、Hepatology、J Allergy Clin Immunol、PloS Pathogen、J Hepatol等SCI收录的国外杂志发表论文200余篇。

人类的免疫应答需要在体内进行，由于受到伦理限制，不能够直接以人为实验对象。啮齿类动物是广泛应用于实验研究的小动物模型，目前免疫系统发育分化及功能研究大多来源于这些模型，但是因为种属特异性的存在，啮齿类动物模型得到的结论并不能直接推导于人类免疫系统。人类的造血免疫功能研究、感染类疾病、自身免疫病以及肿瘤研究都难以实现体内动态观察。一些研究人员则以灵长类动物为替代对象，试图弥补人类与啮齿类动物之间巨大的种属差异，但是因实验对象操作复杂，经济成本高，并不利于推广。黑猩猩、长臂猿等灵长类动物虽然能感染HIV，但是感染后并不发病，而且属濒危动物，逐渐被禁止使用。因此，亟需一种能够应用于人类免疫应答的小动物模型，免疫系统人源化小鼠便应运而生。免疫系统人源化小鼠是指在免疫缺陷小鼠植入人的造血细胞、淋巴细胞或组织而具有人的免疫功能的小鼠模型，为了解人类免疫系统及其免疫应答的重要工具。本文将已有的免疫系统人源化小鼠模型的构建策略、改进方案、应用情况及存在的问题等方面逐一进行综述。

1人源化小鼠的发展历史

免疫系统保护人类抵抗病原微生物的感染，但是由于缺乏合适的小动物模型，关于人类的免疫系统生理及病理的很多机制并未研究得十分清楚。小鼠是应用最为广泛的模式实验动物，由于长期的进化差异，导致人类和小鼠产生种属特异性。在小鼠体内重建人源免疫系统，将为解决这一难题提供一个理想的小动物模型。早在1988年，Mccune等[1]发现在重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中植入人胎肝干细胞、胎胸腺和胎淋巴结可以支撑人源T细胞和B细胞的重建。同时，“PBL-SCID”模型也诞生了，即在SCID小鼠中植入成熟人源免疫细胞以在小鼠体内重建出具有功能的人源化免疫系统[2]，但是由于SCID小鼠的NK细胞对外源细胞的排斥作用，随年龄增长出现小鼠T、B细胞，即发生“渗漏现象”等因素，均极大程度的限制了重建[3,4]。靶向突变重组活化基因Rag1或Rag2同样可以使受者小鼠的T、B细胞缺陷，并且该小鼠不会发生渗漏现象，但过强的NK细胞和天然免疫细胞活性同样制约着人源造血干细胞(HSCs)的植入能力。随后通过SCID缺陷小鼠与NOD背景小鼠回交，产生了NOD/SCID小鼠，该小鼠NK细胞活性及天然免疫细胞的功能更低，可以更好地支持重建，所以在接下来的很长一段时间里，NOD/SCID小鼠被认为是用于人源化重建的最理想受者小鼠[5-7]。然而，当研究者用造血干细胞进行免疫重建时，残存的NK细胞和天然免疫细胞活性，仍然成为了难以跨越的障碍。在HSCs-NOD/SCID小鼠中，50%的hCD45阳性的人源白细胞都是hCD19阳性的B细胞，仅有很少的髓系细胞重建，并且几乎没有T细胞和NK细胞的重建[8]。为了探索残存的NK细胞对脐血造血干细胞植入的影响，研究人员将NOD/SCID小鼠的NK细胞清除以后再植入脐血造血干细胞，结果发现重建水平大大提高，但是并没有影响重建的细胞谱系分化[9]。我们实验室对该模型中重建的B细胞进行了进一步的研究，发现不同脏器的人源化B细胞表现出不同的成熟阶段，骨髓中以不成熟的IgM-IgD-CD24hiCD38hiB 细胞为主，而脾脏和外周血中则以成熟的CD5+IgM+IgD+CD24intCD38intCD19+B 细胞为主[10]。随后，β2微球蛋白基因缺陷的小鼠通过与NOD/SCID小鼠杂交，获得了一个新的用于人源化小鼠构建的鼠种NOD/SCID/B2mnull，即便是更少的脐血造血干细胞的植入，也可以获得相比于NOD/SCID小鼠更高的重建水平[11]。但是该小鼠仍残存的NK细胞对人源化的T细胞和B细胞的成熟产生了很强的抑制作用[12]。IL-2受体伽玛链(IL-2Rγ)缺陷小鼠的引入，使人源化小鼠模型的构建进入了崭新的历史篇章。IL-2Rγ是细胞因子IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21等传递信号所共同需要的受体成分，它的缺陷将直接导致T、B细胞发育受损，NK细胞完全缺失[13,14]。基于该基因缺陷所派生出来的几种重度联合免疫缺陷小鼠均大大的促进了人源化免疫系统的重建水平，如NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl(NSG),NODShi.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug(NOG)，129S4-Rag2tm1FlvIl2rgtm1Flv(BRG)，NOD.Cg-Rag1tm1MomIl2rgtm1Wjl(NRG)等[15-17]。以上几种小鼠品系的建立均克服了残存NK细胞的限制性问题，受者小鼠的三缺陷(T、B、NK细胞均缺陷)使得它们成为当前最为理想的模型小鼠。用CD34阳性的脐血干细胞在NOG小鼠中进行重建，获得了较NK细胞清除小鼠或者NOD/SCID/B2mnull小鼠更高的植入水平。在HSCs-NOG人源化模型中，不仅使CD45阳性细胞的重建获得6倍于NOD/SCID小鼠的高植入水平，同时也出现了多谱系的细胞分化，这其中不仅包含了人源的T细胞、B细胞以及NK细胞，还出现了髓系细胞的重建[17]。后续的研究者为更加完善人源化免疫系统的重建，也采用了一系列的基因工程小鼠作为受者鼠，但大都基于上述三缺陷小鼠，我们将在“促进人源化重建的方案”一节中详细阐述，在此不再赘述。

2人源化小鼠的重建策略

若要成功构建人源化小鼠模型，诸多因素制约着重建效果，如供者材料的类型，植入的途径，受者鼠的品系、年龄、实验前处理等等。由于有大量的条件影响着人源化重建的效率，也很难直接比较出目前哪一个方案才是最优的。因此，如果能严格的控制单一变量来进行重建，会使我们对重建过程有一个更好的理解。

2.1供者材料类型早期的人源化小鼠模型直接采用人的外周血淋巴细胞(PBL)作为供者来源，将其直接转输给SCID缺陷小鼠，构建PBL-SCID人源化小鼠模型。在该模型中，不仅能够得到多谱系的人源化免疫系统，而且能够维持长时间的重建。由于植入的是异种来源的成熟T细胞，一个很致命的问题随之产生，便是小鼠会随时间推移而产生移植物抗宿主疾病(GVHD)[18]，这就极大地限制了功能性实验所能开展的周期。为了克服这一困难，供者材料便被造血干细胞所替代，其来源也极其广泛，包括脐带血、骨髓、胎肝或者G-CSF处理过的成人外周血[19]。虽然可以获得大量的G-CSF处理过的成人外周血造血干细胞，但实验结果表明其是目前重建效率最低的造血干细胞，对该模型的使用也是最少的[20]。相对来说，脐带血来源较为广泛，并且一般作为医疗垃圾处理，不会对供者造成伤害。通常情况下，一份脐带血可以分离获得2×105～1×106个造血干细胞[20]。可见，一份脐带血干细胞所能用于重建的小鼠非常有限，如果后续实验分组较多，很难控制造血干细胞的单一来源因素。除此之外，重建效果也依赖于植入的细胞的量，更多的干细胞往往能够获得更高的重建水平。于是如何获得大量均质的造血干细胞也成为科学家亟需解决的问题。

关于体外扩增造血干细胞的问题，已经有较长的研究历史，并有较多的实施策略[21,22]。但问题依然存在，如有些扩增条件会使干细胞获得向某些特定细胞谱系发育的潜能，植入受者小鼠以后所重建的免疫系统是不完善或畸形的[21]。胎肝是另一个造血干细胞的来源，它的发育分化能力与脐带血干细胞相当，更主要的是，分离一份胎肝所获得的干细胞总数要远多于一份脐带血，为能够重建单一供者来源的免疫系统人源化小鼠提供了很好的保障。为了使造血干细胞有更接近生理的发育场所，科学家们构建了BLT人源化小鼠模型，即通过手术的方法将人胎肝、胎胸腺组织植入免疫缺陷小鼠，并静脉转输胎肝来源的造血干细胞、胎胸腺组织更好地支持人源T细胞的发育分化[23-25]。因其T细胞的良好发育，较多地被应用于HIV感染的研究[26]。

2.2受者小鼠的选择及预处理一般认为受者小鼠的免疫功能缺陷程度越高，能够越好的支持重建。在将IL-2Rγ缺陷小鼠引入到人源化重建中以后，获得了如BRG或NOG等T细胞、B细胞以及NK细胞的三缺陷小鼠，均很大程度地促进了重建水平。虽然它们在B细胞、DC细胞的重建中没有表现出差异，但是NOD背景的NOG小鼠，因其更低的髓系细胞功能，显示出更好的T细胞、NK细胞的重建能力。除背景以外，受者鼠的年龄也影响着重建水平，新生小鼠相比于成年鼠表现出更高的重建水平[27]。新生小鼠的细胞转输操作相对困难，常用的有脸部静脉注射、肝内注射、心内注射等，而成年鼠的转输仅需尾静脉注射便可，操作相对容易。除此之外，性别也被发现影响着重建水平，雌鼠的重建能力要显著高于雄鼠[28]，那么用成年雌鼠实验，获得更好的重建效果而又避免了新生鼠麻烦的操作也是一个不错的选择。除此之外，细胞转输前的小鼠处理也是一个尤为重要的因素。根据日本CIEA发布的操作流程，要在转输前一天对受者小鼠进行辐照，成年鼠辐照剂量2～2.5 Gy，新生鼠则是1 Gy。操作时，应根据实际情况进行调整，如小鼠体重小于18 g，再以该剂量进行实验，则会大大提高死亡率。

3人源化小鼠的改进方案

一个理想的免疫系统人源化小鼠不仅要有人源的多谱系免疫细胞，还应该使各细胞亚群的比例和定位也与人类接近，更重要的是要具有功能。由于进化上的差异，小鼠的细胞因子往往不能很好地作用于人的造血细胞，因此在发育和功能上往往是受损的，那么如何克服这一困难，科学家们在人源细胞因子补给上做了大量的努力和尝试，使人源化小鼠模型获得了巨大的进步。

3.1注射可溶性细胞因子最早的细胞因子补给策略便是给受者小鼠直接注射可溶性人源细胞因子蛋白。我们实验室通过对PBL-NOD/SCID人源化小鼠模型注射人催乳素，同时促进了T细胞和B细胞重建，并提高了细胞免疫应答和体液免疫应答能力[29]。在同一人源化小鼠模型中，我们通过注射重组人IL-15，发现T细胞重建水平、增殖能力以及细胞因子分泌能力均显著提高[30]。对SCID小鼠同时补充人TPO、IL-3和GM-CSF，无论是在成人骨髓重建模型还是脐带血重建模型，都能显著促进重建水平[31,32]。随着后续的重建模型中受者小鼠的品系不断进步，细胞因子的重要作用也逐渐突显出来。因为NOG小鼠本身可以支持较高水平的人源化重建，细胞因子的作用也逐渐被聚焦到重建较差的NK细胞、髓系细胞和较弱的适应性免疫应答等方面。Tanaka等[33]更关注G-CSF对髓系细胞的作用，他们在已经重建4～6个月的HSC-NOG小鼠中注射人源G-CSF，5 d以后便观察到中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞都得以增多。

虽然外周血造血干细胞重建效率较低，Andre等[34]在PBSCs-NOG小鼠模型中外源补充人IL-7，不仅提高了植入水平，还可以促进多谱系的细胞分化，达到等同于脐血干细胞的重建水平。目前NK细胞的体内研究通常依赖小鼠模型，但是由于NK细胞的很多生物学特性在人和小鼠中有着较大的差异，那么建立拥有人类NK细胞的人源化小鼠模型就显得十分必要。很多研究小组在BALB/c-rag-/-γc-/-(BRG) 小鼠中做的人源化尝试均表现出较差的NK细胞重建能力。Huntington等[35]认为小鼠的IL-15对人的细胞弱反应性是症结所在，他们外源施加人IL-15给人源化重建的小鼠，但是促进效果微乎其微，当以IL-15-IL-15Ra复合体形式给予，NK细胞的增殖和分化都得到了大幅度提升。

对于细胞而言，它的分化、发育、增殖乃至活化，均受到多个细胞因子信号的协同作用，所以单一的细胞因子补充在某些特定情况下也许并不足够。Connie等[36]对NOD/SCID小鼠中进行次级重建的人源化小鼠模型连续两周注射人SCF、IL-3、GM-CSF、TPO，淋巴细胞和髓系细胞的发育分化均得到了较大的促进。Ding等[37]构建了HSCs-NOD/SCID小鼠，并且在4周以后给予人源FLT3L,DC细胞的数目和功能都得以显著提高[37]。当然，并非给予越多的细胞因子效果就越好，选择什么细胞因子、给予途径、给予频率、给予方式等都需要仔细考量和多次尝试，最终确定最佳的重建方案。

3.2构建病毒载体病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可以将遗传物质带入细胞，从而实现外源基因的表达。由于腺病毒载体的感染效率高，荷载量高，不产生插入突变，普遍认为是较为理想的体内基因传递工具[38]。Pek等[39]采用直接注射人IL-15或用腺病毒载体过表达人IL-15都能够帮助促进NK细胞的发育和成熟，但是两者的效果相比，没有显著差别。虽然这些手段均可以提高NK细胞的重建水平，但是NK细胞的比例还是相对较低，而且远远低于正常人的生理水平。

借助慢病毒载体的基因传递方式可以完成外源基因在宿主细胞基因组的整合，促进目的基因的表达，即使细胞分裂，目的基因依然可以在子代细胞继续表达[40]。研究人员用携带人源IL-7基因的慢病毒载体在Rag2-/-γc-/-小鼠中过表达人IL-7分子，在长达6个月的观察期内，小鼠血清中人IL-7的含量一直维持较高水平。IL-7的过表达显著促进了外周血中T细胞和B细胞的比例，但是对整体的免疫重建水平的提高作用微乎其微，而且也并没有影响到T细胞亚群的分化[41]。

虽然通过病毒载体携带外源基因进入宿主体内实现体内的过表达是一个很高效的方式，但是依然存在很多问题亟待解决。比如若要获得足够的病毒载体，通常需要大量而复杂的病毒包装工作和病毒纯化工作；腺病毒载体本身可能引起人源细胞的免疫应答，甚至导致一定的病理损伤，而使得从实验对象上看到的表型并不能反映正常生理条件下的情况；慢病毒载体的整合能力则更是一把双刃剑，不确定的整合位点将对宿主产生不可预知的伤害，甚者可能是致死性的。所以基于种种考虑，利用病毒载体作为基因传递的工具还是受到很多限制的，那么找到一种更简单、更高效的基因传递方式显得尤为重要。

3.3高压注射基因表达质粒高压注射是一种广泛应用于体内基因过表达的技术手段，最成功的应用便是在啮齿类动物的肝细胞中导入外源基因的过表达载体，操作要领一般遵循在5～7 s内，从小鼠尾静脉注入等同于其体重8%～10%的载体溶液[42]。Chen等[43]运用高压注射手段解决人源化重建中细胞因子不足的问题。首先，他们在人源化小鼠中高压注射人IL-15 和Flt3l表达载体，NK细胞的重建水平显著提高，并且诱导出的NK细胞能够正常表达活化性受体和抑制性受体，能够被诱导引起NK细胞依赖的肝脏损伤，并且体外具有杀伤靶细胞的能力，表明重建的NK细胞是具有功能的。除此之外，他们还尝试表达更多种类的细胞因子，观察它们对免疫重建的影响。如过表达人GM-CSF和IL-4,M-CSF促进树突状细胞、单核巨噬细胞重建,或者人EPO和IL-3促进红细胞重建。有了促进重建人源化NK细胞的方案，为后续开展人NK细胞病理和生理的研究提供了模型。

在他们后续的研究中，发现在疟原虫感染过程中，人NK细胞能够与被感染的红细胞相互作用并杀伤靶细胞，进而找到对此过程起到关键作用的分子LFA-1[44]。在对过表达人GM-CSF和IL-4,M-CSF的小鼠模型所展开的后续工作中，他们发现除了可以提高树突状细胞的重建能力，对T细胞和B细胞的成熟也起到了促进作用，由此适应性免疫应答在该小鼠模型中能够成功被诱导[45]。在M-CSF过表达的小鼠模型中，成熟的单核细胞和组织居留的巨噬细胞都可以成功发育，并对流感病毒感染或者分支枝杆菌感染起到增强的保护效果[46]。

在高压注射表达细胞因子的人源化小鼠模型中，某种细胞因子针对不同细胞种类的特定功能得以突显出来，成为研究细胞因子功能的有力工具。相比于单纯注射可溶性细胞因子，质粒在受者体内可以维持相对较长时间，一次注射就可以达到表达目的，而细胞因子鉴于其半衰期较短，往往需要反复注射，增加了操作的复杂性和经济成本。但是高于生理水平的表达细胞因子也许并不一定反映的是生理条件下的真实情况，甚至可能导致免疫细胞的耗竭。如果能够对所表达的细胞因子表达时相、表达剂量精密调控，将对重建多谱系的人源化免疫系统起到非常重要的作用。

3.4构建基因工程小鼠对受者小鼠进行基因改造用于模型构建，最大程度降低了各种操作手段中人为因素等造成的系统误差，由此得到的成功构建的小鼠模型将更加稳定。Richard A Flavell研究小组运用基因敲入技术在免疫系统人源化重建方面做出了一系列优秀的工作[47-50]。他们将人源目的基因敲入小鼠相应基因的位点以替代其表达，并且所选择的目的细胞因子一般具有以下几个特点：①小鼠的细胞因子不作用或弱作用于人源细胞；②人源细胞因子不作用或弱作用于小鼠细胞以确保人源细胞的竞争优势；③人源细胞因子不单纯由造血细胞产生；④小鼠不会因为细胞因子的缺失而致死，或者敲入的人源细胞因子通过交叉反应足以挽救小鼠[47]。

因为人源化小鼠的髓系细胞重建较差，而IL-3和GM-CSF是对髓系细胞发育分化和发挥功能很重要的两种细胞因子，他们在Rag2-/-γc-/-小鼠的基础上构建了人IL3/GM-CSF基因敲入小鼠，但是结果却表明这两个细胞因子在髓系细胞重建方面的促进作用并不是非常显著[47]。有趣的是，同样的基因也通过转基因技术引入到NOG小鼠体内，多谱系的髓系细胞却能够被促进发育分化[51]。虽然两种基因工程小鼠带有相同的人源基因，后者却有着更高的髓系重建水平，可能小鼠自身的天然免疫系统活性差异是问题的关键所在。Richard A Flavell 小组在Rag2-/-γc-/-小鼠基础上构建了人TPO基因敲入小鼠，在该小鼠中进行的人源化重建水平得以提高，多谱系免疫细胞发育分化，血小板的数目也有所提高[48]。尤其值得指出的是，小鼠自身的TPO虽然被替代，但是其巨核细胞并未受到影响，也就是说小鼠的TPO基因被替代，功能却没有完全被替代。将M-CSF引入到Rag2-/-γc-/-小鼠的相应基因位点用于人源化的构建，骨髓、脾脏、外周血、肺脏、肝脏和腹腔中更有效地重建出人源单核细胞和巨噬细胞，并且它们有着更强的迁移、吞噬和活化能力[52]。除此之外，他们团队还通过转基因技术在Rag2-/-γc-/-小鼠中引入人源信号调节蛋白阿尔法(SIRPα)基因，通过负调受者小鼠巨噬细胞的吞噬功能显著提高了人源化的水平[49]。在生理条件下，CD47-SIRPα这一个分子对通过传递“请勿吃掉我”信号来抑制巨噬细胞的吞噬作用[53]，对于造血干细胞、红细胞以及血小板等起到重要的维持作用[54]。

虽然这些基因敲入小鼠对于人源化免疫系统的重建起到了不同程度的促进作用，但是仍没有任何一个小鼠模型能够产生完整的并且有功能的髓系免疫系统。最近Richard A Flavell 团队创建了一个较以往工作最为复杂的基因工程小鼠，它基于前期研究成果，整合了人源M-CSF、IL-3/GM-CSF、TPO和SIRPα在同一只Rag2-/-γc-/-受者小鼠上，并将它根据是否带有人SIRPα基因分别取名MISTRG或者MITRG。这两种小鼠最大程度地支持人源化造血生成和髓系生成，有趣的是，还促进了NK细胞的重建，其重建水平在以往任何模型中都是难以达到的[50]。

Billerbeck等[55]通过转基因的技术在NSG小鼠中表达人SCF、GM-CSF和IL-3，简称NSG-SGM3小鼠。正如他们所预期的，髓系细胞的重建水平显著提高，尤其是树突状细胞(DC)的重建优势尤为明显。有趣的是，在转基因小鼠中，具有抑制性功能的调节性T细胞(Treg)的重建也显著被提高了。随后，该研究小组在NSG小鼠基础上构建表达人SF、IL-3和GM-CSF的小鼠模型，简称NSG-3GS小鼠。同样的，在该小鼠中，人源化髓系细胞显示出较大的重建优势[56]。有研究者在NSG小鼠中表达膜结合型人SCF和KITL，也达到了促进髓系细胞重建的目的[56]，但是在该模型中，我们并没有看到与MISTRG小鼠模型中同样能够促进NK细胞重建的现象，这可能归咎于在他们的人源化小鼠模型中单核细胞和巨噬细胞的重建相对较差，不能产生足够的人IL-15支持NK细胞重建。

就基因工程小鼠而言，无论是新生小鼠还是成年小鼠，在造血干细胞植入之初便能够提供人源化细胞因子，并且可以一直稳定提供。因此，对于一个造血干细胞发育过程中各个关键节点，基因工程小鼠所提供的细胞因子均可以覆盖，这一优势，对其他的外源细胞因子补给方式来说是难以达到的。

4人源化小鼠模型的应用

免疫系统人源化小鼠模型的构建初衷便是更好地解决人类免疫生理及病理中的问题，从诞生之初，研究者们便不断尝试借助该模型在造血功能、感染性疾病、自身免疫病以及肿瘤学等领域有所新的发现和突破。但是由于起步较晚，困难较多，很长一段发展历程都围绕如何更好地构建模型展开，实际应用尤其在临床疾病方面的研究进展比较缓慢。

4.1造血及免疫系统研究利用人源化小鼠模型研究造血是在所有应用领域最为成熟的，因为在不断的尝试更好地重建人类免疫系统的同时，也对影响某些细胞亚群发育所必需的因素探究的比较清楚，比如前面所提到的细胞因子的补充，大多获得了较好的促进重建的效果。Chen等[57]在利用细胞因子促NK细胞重建的人源化小鼠模型中，进一步发现一群同时表达NK细胞和髓系细胞标志(CD56+CD33+CD36+)的亚群，它可以丢失髓系标志而获得NK细胞功能性受体表达最终发育为成熟NK细胞，揭示了NK细胞发育可能源于髓系前体细胞。

除细胞因子外，T细胞发育需经历阳性选择和阴性选择，NK细胞需经历教育等过程都将对细胞功能产生重要影响。人的T细胞在小鼠胸腺中经历选择，未能获得HLA限制性，为了解决这个问题，Shultz等[58]将HLA-A2基因转入NSG小鼠，通过转输造血干细胞重建人免疫系统，值得注意的是，重建的CTL细胞显示出更高的功能性成熟，在应对EB病毒感染时，表现出更强的HLA限制性的细胞毒活性。除此之外，普通NOG小鼠中重建出的人源T细胞，用抗CD3、CD28抗体刺激既不会产生增殖也不会分泌IL-2，用多种抗原刺激小鼠，往往只能产生抗原特异性的IgM，而少有IgG的产生[59]，这都说明免疫细胞虽然能够在小鼠中完成发育，但是人鼠体内微环境的差异导致发育出来的细胞功能受损。将人MHCⅡ分子HLA-DR通过转基因技术导入NOG小鼠并进行人源化免疫重建，体液免疫应答能力显著增强，在血清中可以检测到抗原特异性的IgG的产生[60]。

人源化小鼠模型除了对已知细胞亚群的发育过程、功能性分子的探究，对新细胞亚群的发现及功能研究也起到了重要的作用。ILC细胞是新近发现的一类天然免疫细胞，它随血液循环并在周身分布，在抵抗感染、炎症过程和组织重塑等方面发挥着重要的作用[61,62]。目前的研究主要以小鼠和少量临床资料为实验对象，关于人类ILC细胞在体内的发育分化过程及功能研究仍留有大量空白。Bernink等[63]在NSG-HIS小鼠模型的结肠中检测到人ILC3(Lin-CD127+cKit+NKp44+)和ILC1(Lin-CD127+cKit-NKp44-),并且在DSS诱导肠炎模型中检测到ILC1的比例增加。最近，同一小组在人源化小鼠的外周血、脾脏、肺脏和小肠均检测到Lin-CD161+cKit-NKp44-的ILC1细胞，并且转输实验证明ILC1能够向ILC3进行转化[64]。可见，人源化小鼠已经为人类ILC细胞的发育及功能研究提供了很好的模型，随着研究的深入，将来可能对ILC各个细胞亚群的基础生物学特性和免疫功能研究提供更多的帮助。

4.2感染性疾病研究由于很多病毒只感染人类，常规的小鼠实验并不能作为理想的动物模型，免疫系统人源化小鼠的出现在一定程度上解决了这一难题。伴随着人源化小鼠模型构建日趋成熟，诸多感染类疾病也开始有了新的研究进展，较为典型的如HIV病毒、EB病毒、登革热病毒等等。

HIV的感染严重威胁着人类的健康，利用HIV感染人源化小鼠模型发现，单纯的抗病毒治疗或中和抗体治疗都很难清除潜伏感染的病毒，而用潜伏激活子联合中和抗体治疗，有效地控制了血浆中病毒反弹现象[65]。同样利用人源化小鼠模型，无论在急性还是慢性HIV感染中，利用单克隆抗体特异清除pDC均显著降低了IFN-I和ISG的表达，并伴随病毒复制的增加[66]。新近一项研究表明，人源化小鼠中持续性感染HIV可以导致ILC3细胞的大量减少，并发现该过程依赖pDC、IFN-I和CD95/FasL这条途径，无论是清除pDC还是阻断IFN-I或者CD95/FasL信号通路都可以挽救ILC3的减少[67]，这或许将对临床治疗HIV感染起到一定的指导作用。

EB病毒是一种特异性感染人的双链DNA病毒，被感染者通常终身携带病毒，并不需要治疗。然而有时EB病毒的感染会引发淋巴瘤，威胁着人类的健康[68]。由于缺少动物模型，给相关研究带来一定困难。对人源化小鼠进行EB病毒感染，可以产生淋巴瘤症状，伴随高病毒血症、白细胞增多、血小板减少等症状，并导致2/3小鼠死亡[69]。EB病毒感染通常会引起霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)，研究者发现一个有趣的现象，在人源化小鼠中感染EB病毒时，若小鼠以B淋巴细胞为主[71,72]，则易于发生非霍奇金淋巴瘤，相反，若以T淋巴细胞为主，则倾向发生霍奇金淋巴瘤[70]。

登革热病毒是一种依赖蚊虫传播的感染性疾病，不同人的感染症状差异也较大，从亚临床症状到急性发热甚至重度登革热休克综合征。Jaiswal等利用登革热病毒感染NSG-HLA-A2人源化小鼠，同时看到了体液免疫应答和细胞免疫应答，但是缺憾的是产生的抗体仍以IgM为主[71,72]。所以能够尽快完善人源化免疫系统的功能，将会使人源化小鼠的应用向前再推进一步。

4.3自身免疫病研究自身免疫病的研究也是人源化小鼠较早应用的领域之一，20世纪90年代，通过CB17-SCID小鼠转输Ⅰ型糖尿病患者的PBMCs，可以观察到胰岛抗原特异性抗体的产生；转输风湿性关节炎患者滑膜液细胞或PBMCs，可产生风湿性关节炎的相关抗体。但是这些模型转输的细胞均为人的成熟T细胞，不利于研究人的免疫系统功能，也不能用于研究宿主体内发育而来的耐受性细胞的改变。CTLA-4成为了新近肿瘤生物治疗中的明星分子，利用抗CTLA-4单克隆抗体有效活化抗肿瘤效应性T细胞[73]。然而除了抗肿瘤的效果外，病人还表现出皮炎、结肠炎、肝炎、胰腺炎和垂体炎等病症，对其发病机制和病理情况缺少进一步的研究[74]。Vudatlu等[75]人利用胎肝造血干细胞构建人源化小鼠，在抗CTLA-4抗体处理小鼠中可以检测到抗核抗体，并发生体重下降和肝炎等病症，作者发现，除T细胞过度增殖活化外，Treg细胞到病理部位的募集、与抗原递呈细胞的作用也大大受损。个体之间的发病机制往往也存在差异，针对个人的人源化小鼠会更有意义，Kalscheuer等[76]从成人骨髓分离造血干细胞用于人源化重建，正常人来源的可以成功发育出包含Treg在内的T细胞并产生较好的宿主耐受性，而1型糖尿病病人来源的干细胞重建出更多具有活化性和记忆性表型的T细胞，揭示了发病机制可能源于造血干细胞的内在因素。这种“个人免疫系统人源化小鼠”表现出更强的针对性，对其他免疫系统功能失调导致的疾病机制研究也提供了很好的模型。

4.4肿瘤学研究当前的肿瘤学研究主要依赖免疫缺陷小鼠的荷瘤模型，对于人的体内免疫细胞、免疫分子等功能研究尚缺较好的动物模型。最近，人的IL-2基因被导入NOG小鼠用以促进免疫系统重建，有趣的是，大量重建出CD3-CD56highCD16+/-表型的NK细胞，不仅表现出与正常人外周血NK细胞相当的细胞毒颗粒和细胞因子分泌能力，在对荷载的K562细胞应答中也表现出较强的抗肿瘤效应[77]。除对造血功能的生物学研究，对淋巴瘤的相关阐释是人源化小鼠做出巨大贡献的领域之一，因其可以看到疾病的异质化，能够反映特定病人的情况，相比于普通小鼠模型有着巨大优势[78]。HTLV-1是20世纪70年代后期发现的第一个人类逆转录病毒，虽然大多数感染个体终生携带，而约5%的感染者经过潜伏期发展为T细胞淋巴瘤，脊髓病变或下肢瘫痪[79-81]。在NOG小鼠骨髓腔注射人CD133阳性干细胞成功构建IBMI-huNOG人源化小鼠后，利用HTLV-1感染4～5月后，可诱导外周CD4阳性T细胞快速增多并产生类似T细胞淋巴瘤的分叶核细胞。在该模型中，不仅看到病毒感染的T细胞具有偏好性，主要以CD4阳性T细胞为主并与CD25的表达相关，也看到感染过程中细胞免疫应答和体液免疫应答均参与抵抗病毒[82]。通过对荷载霍奇金淋巴瘤的人源化小鼠注射抗CCR4单克隆抗体，也能成功介导人源化NK细胞发挥较强的抗体依赖的细胞毒效应(ADCC)，该模型对于体内研究NK细胞抗肿瘤效应提供了一个有力的模型[81]。同样的效应也被另一个研究小组在ATLL、CTCL细胞系荷瘤小鼠中观测到[83]。成功的病毒感染模型将对临床治疗靶点、疫苗研发策略等提供开发和评估平台。人源化小鼠模型具有很强的应用性，对于很多生理、病理现象能够提供体内细胞及分子水平的机制阐释，对于新型病毒研究、病毒疫苗研发、临床治疗策略的评估等均有一定的借鉴意义。

5人源化小鼠仍存在的问题及展望

人源化小鼠模型已经走过了近四十年的历程，中间经历了几次里程碑式的发展阶段，也让我们对人源化小鼠模型有了更坚定的信念。尽管如此，当前的模型仍存在很多亟待解决的问题。虽然受者小鼠的免疫缺陷程度越来越高，然而当前仍主要局限于淋巴细胞的缺陷，天然免疫细胞对植入的干细胞仍有较强的抑制作用；T细胞在小鼠胸腺中发育，阳性选择的过程是依赖小鼠MHC分子的，不仅使细胞免疫受损，B细胞产生抗体的功能也显著降低，不能发生亚型转换；虽然在BLT模型中外源植入的人胎胸腺组织可以克服这一难题，但是免疫系统趋于以细胞免疫为主，体液免疫功能极低；如前所述，科学家们已经采用了各种各样的办法补充人源细胞因子，在一定程度上恢复了人源免疫细胞的功能，但是细胞因子并非万能，细胞发育过程还需要与基质细胞相互作用，发挥效应功能需要趋化因子、黏附分子、共刺激分子等多因素的协同作用，免疫效应功能结束还需要免疫调节机制等环节都难于在目前的任一人源化小鼠模型中实现。

基因工程小鼠是当前用于较高水平人源化重建的主力军，尤以Richard A Flavell 团队的MISTRG/MISTG小鼠为代表，可以重建出最为完善的功能性髓系免疫系统，然而中性粒细胞的终末分化、从骨髓中的迁出、在外周的存活等问题仍没有很好的解决；在干扰了小鼠自身红细胞的同时，人源红细胞又很难重建，小鼠的生存状态难以保证；该模型对天然免疫系统的重建有着显著的促进作用，但是对适应性免疫系统没有作用，导致适应性免疫应答很弱。多细胞因子的替代确实起到了较为显著的促进人源化重建的作用，但是离完美无瑕还相去甚远。细胞因子网络的强大作用不能够仅仅通过替换几个关键因子，就达到完全等同于正常人免疫系统的终极目标，而且细胞因子也并不是决定人源化重建水平的唯一限制因素。 除此之外，基因工程小鼠可以终生提供人源细胞因子，目前还没有可控制细胞因子基因表达的开启和关闭的小鼠模型，很难看到某一细胞因子于造血过程的某一具体节点的作用。

人源化免疫系统在小鼠中得到越来越好的重建，然而并没有对宿主实现完全耐受，如在BLT模型中，人的T细胞是由移植的人胎胸腺所介导的选择，其对宿主细胞产生攻击进而诱发GVHD(移植物抗宿主疾病)[78,84,85]。即使只移植造血干细胞实现免疫系统人源化，干细胞发育过程完全依赖小鼠基质细胞，在重建6个月以后也会发生GVHD的现象。除此之外，人源巨噬细胞还可以吞噬小鼠的红细胞和血小板，严重影响宿主生活状态。由此可见，以往的工作一般着眼于如何使小鼠更好的接纳人源细胞，那么现在也需要关注人源细胞对宿主的耐受。

另一个关键问题便是在NOG小鼠中较难重建淋巴结，而淋巴结对于适应性免疫应答起到至关重要的作用。我们实验室与Barbier等均对新近发现的小鼠肝脏引流淋巴结进行了描述[86,87]，但是对其免疫功能仍知之甚少，尤其对于人肝脏引流淋巴结更是缺少体内功能研究。但是在人源化小鼠模型中，肠系膜淋巴结较易重建，而其他部位如腹股沟淋巴结、腋窝淋巴结、臂淋巴和肝脏淋巴结等均难以重建，通常以少量甚至没有人源淋巴细胞的情况出现，这就给淋巴结相关功能研究造成了阻碍。有研究者通过在Rag-/-γc-/-小鼠中过表达胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)帮助诱导LTi细胞，进而重塑淋巴结[88]。更早一些的一项研究，利用淋巴毒素β受体的激动剂可以帮助淋巴毒素α缺陷小鼠的淋巴结重塑[89]。这些基于小鼠的研究，或许对人源化小鼠的淋巴结及相关淋巴组织形成有借鉴意义。

由于当前的人源化小鼠模型仍不完善，基于此的应用仍以探索性为主，鲜有对临床起到重要指导意义并付诸行动的研究出现。随着越来越多新的细胞因子被发现，新的技术被采用，在接下来的研究中，免疫系统人源化小鼠一定会向着更加完善，更具功能的方向飞速发展，日趋完善的免疫系统人源化小鼠模型必将成为人类免疫系统生理和病理研究中的有力工具。

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[收稿2016-01-18]

(编辑倪鹏)

Construction and application of humanized immune system mice

WANGYan-Shi,TIANZhi-Gang.

InstituteofImmunology,UniversityofScience&TechnologyofChina,Hefei230027，China

[Abstract]Humanized mice have been developed for nearly 40 years though it was hard to construct available model at beginning.With more immunodeficiency of the host mice,the reconstructed humanized immune system (HIS) reached higher levels.Not only was the background of the hosts essential for the reconstruction,but also several strategies for administration or over-expression of human cytokines in the host mice achieved big breakthroughs.As the humanized mice model is becoming more improved,it has been used in various areas,such as hematopoiesis,infectious diseases,autoimmune diseases,cancer and so on.Now,human immune cells could be almost complementally biologically developed in the niche of the mice,however,due to species-specificity,the humanized immune cells were usually functionally impaired.So,what we learnt from the humanized mice could not reflect the whole immunological process in humans.Thus,the investigation for improving humanized mice model will be continued in order to provide a more promising platform for pre-clinical therapeutics.

[Key words]Immune system;Humanized mice;Infectious diseases;Tumor;Hematopoiesis;Autoimmune diseases

中图分类号R392

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)03-0289-10

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.001

①本文受国家973基础科学项目(No. 2013CB944902)资助。