ISSR分子标记鉴定巴马香猪

金玉兰， 李婉丽， 李松， 李玺洋， 杨阳， 陈秋虹， 孙群*

(1. 四川大学轻纺与食品学院，成都610064； 2. 四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610064； 3. 广西壮族自治区分析测试研究中心，南宁530022)

ISSR分子标记鉴定巴马香猪

金玉兰1， 李婉丽2， 李松2， 李玺洋2， 杨阳2， 陈秋虹3， 孙群2*

(1. 四川大学轻纺与食品学院，成都610064； 2. 四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610064； 3. 广西壮族自治区分析测试研究中心，南宁530022)

结合线粒体基因和ISSR两种DNA分子标记技术对巴马香猪、环江香猪、藏猪、巴马本地土猪和成华猪进行种类鉴定。研究从55条ISSR引物中筛选出1条带型清晰、重复性好的引物53可以鉴别巴马香猪、环江香猪、藏猪、巴马本地土猪和成华猪。巴马香猪与藏猪线粒体基因分析结果表明，藏猪具有特异的短串联重复片段“TGTGTACGCA”，可用于进一步鉴别巴马香猪与藏猪。ISSR分子标记与聚类分析结果显示，引物53可以鉴别5种猪并成功鉴定了一份未知种类的巴马产猪肉样品。结果表明，ISSR分子标记与线粒体基因联合分析可以快速准确鉴别巴马香猪、环江香猪、藏猪、巴马本地土猪和成华猪。

巴马香猪；鉴定；线粒体基因；ISSR

我国是世界上猪品种资源最丰富的国家之一，拥有70多个地方猪品种。我国地方猪品种具有繁殖性能高、肉质好、耐粗饲、抗病力强等优点，但由于受国外引进猪品种的竞争，地方猪品种的饲养量已经大大减少，甚至有许多地方猪品种已处于濒危状态(欧阳解秀，王立贤，2013)。巴马香猪起源于广西壮族自治区巴马瑶族自治县，是国家级畜禽品种资源保护猪品种之一，属于封闭近交繁殖品种，遗传性能稳定(张莲英等，2011)。巴马香猪具有肉质细嫩、清香可口、风味独特等优良特点，是制作烤乳猪、腊全猪和腌肉的上乘原料，颇受消费者喜爱。然而市场上销售的巴马香猪肉制品真伪难辨，目前对巴马香猪的鉴别主要以外观的描述为主，尚缺乏有效的基因检测手段。为了维持巴马香猪市场秩序，促进其产业发展，亟需探索一种快捷、准确地鉴别巴马香猪肉制品真伪的分子标记技术。

DNA分子标记技术是继形态学、细胞学、生化等遗传标记技术后能够稳定可靠反映物种遗传特点的最新分子标记技术(王春侠，仇敬运，2007)。与核DNA相比，线粒体DNA具有结构简单、严格遵守母系遗传方式、进化速度快等特点，现已在动物的系统发生、物种鉴定和种群结构等研究中得到广泛应用(刘超等，2003；张俊丽等，2010；李楠楠等，2012)。ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记的基本原理是以SSR(simple sequence repeat)的3’端或5’端锚定1～4个随机碱基为引物进行PCR扩增，特异地扩增出具有反向排序的微卫星区域间的DNA序列(Zietkiewiczetal.，1994)，具有成本较低、操作简单、良好的稳定性、重复性、丰富的多态性以及能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化等特点。ISSR技术在动物遗传学中主要应用于遗传多样性、资源鉴定与分类、亲缘关系与系统发育的构建以及动物标记辅助选育等方面(Nagornyuk & Glazko，2007；韩晓磊等，2010；Zamani，2011)。Yang等(2013)在对5种貂(standard-pitchy mink，sapphire mink，brown mink，black mink，white mink)的基因多样性进行ISSR分析时发现，5种貂具有较高的基因多样性，UPGMA聚类分析将5种貂分为2组，其中standard-pitchy mink单独聚为一类，其他4种聚为一类，说明品种间遗传分化程度低。Maltagliati等(2006)用ISSR方法成功鉴定了2份未知属于Valenciahispanica样品。何榆林等(2014)利用ISSR分子标记成功地鉴定了陆川猪及其肉制品。因此ISSR分子标记是一种有效的种质资源鉴定方法。

目前，对巴马香猪的研究主要集中在遗传多样性和亲缘关系(陈丙波等，2003)；另一方面，用ISSR分子标记鉴定哺乳动物肉制品源性的研究不多，特别是对巴马香猪肉源性真伪的鉴别研究更少。巴马香猪与巴马本地土猪和环江香猪亲缘关系较近，肉源真伪不易区分，本研究采用线粒体基因和ISSR两种DNA分子标记建立一种可靠、快速鉴别巴马香猪与巴马本地土猪和环江香猪的方法，同时将该方法推广到成华猪和藏猪进行验证。研究结果对于巴马香猪品牌的保护和市场的规范具有重要意义，也对巴马香猪等地方猪品种的资源保护提供重要的遗传依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉样品分类及数量(表1)：巴马香猪(n=5)，环江香猪(n=3)，巴马本地土猪(n=3)，藏猪(n=2)，成华猪(n=3)，1份巴马产猪肉样。每种样品均取自原产地及纯种养殖场，可以保证样品的纯种性和真实性。

实验所用55个ISSR引物(表2)：其中引物1～34来自何榆林等(2014)，引物35～43来自Maltagliati等(2006)，引物44～55来自Yang等(2013)。自行设计了扩增巴马香猪与其他猪种线粒体差异基因位点的引物A：上游引物5’-AACAAGGTGCTATTC-AGTC-3’，下游引物5’-TCTTTAGGATCTGGAGGG-3’。

表1 实验样品种类、编号及来源Table 1 Details of the pig breeds tested in the study

表2 ISSR引物序列Table 2 ISSR primer sequence

1.2 仪器与设备

PCR仪(Bio-Rad PTC-200)，琼脂糖凝胶电泳仪(Bio-Rad Powerpace Basic)，凝胶成像分析仪(Universal Hood Ⅱ，Bio-Rad)，超微量蛋白核酸分析仪(BioDrop μLite)。

1.3 方法

1.3.1 样品DNA提取及纯度检验 称取生鲜猪肉样品0.5 g，液氮研磨，按照说明书提取DNA(天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒TIANamp Genomic DNA Kit)。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并通过超微量蛋白核酸分析仪检测所提取的DNA质量以及OD260nm和OD280nm浓度，测定DNA纯度OD260nm/OD280nm。-20 ℃保存备用。

1.3.2 PCR 反应及产物检测 反应体系：模板DNA 1.5 μL、引物1 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O补足至25 μL。

反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，退火45 s(引物A的退火温度为55 ℃，引物53的退火温度为51 ℃)，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。PCR反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。线粒体基因分析中的PCR产物送Invitrogen公司进行直接测序。

1.3.3 数据分析 ISSR电泳成像后，利用Quantity One对扩增片段进行UPGMA聚类分析，并比较个体间的相似性。

2 结果

2.1 ISSR分子标记鉴别巴马香猪结果与分析

2.1.1 ISSR分子标记结果 实验对5种猪肉全基因组进行了PCR扩增和带型分析，在55个ISSR引物中筛选出了1个多态性好、条带清晰的引物——引物53：5’-(ATG)6-3’，可用于区别巴马香猪、环江香猪、巴马本地土猪、藏猪和成华猪。如图1所示，引物53在环江香猪(B1、B2、B3)和藏猪(D1、D2)的样品中扩增获得1条1 300 bp左右的特异性条带，而巴马香猪没有该条带。同样地，该引物在巴马本地土猪(C1、C2、C3)和成华猪(E1、E2、E3)中能够扩增出1条700～800 bp的特异性条带，而巴马香猪没有此条带。说明此引物能够将巴马香猪与环江香猪、巴马本地土猪、藏猪和成华猪区分开。ISSR分子标记结果显示，未知肉样C’的条带与巴马香猪的条带一致，因此可以初步判定C’为巴马香猪样品。

图1 引物53扩增出的5个品种猪肉的电泳图谱Fig. 1 Electrophoresis fingerprinting of amplification products from pork of five different breeds

2.1.2 UPGMA聚类分析 为了进一步了解巴马香猪和其他4种猪的亲缘关系，对巴马香猪、环江香猪、巴马本地土猪、藏猪和成华猪进行聚类分析(图2)。UPGMA结果显示，5个猪种分为2个类群，成华猪和巴马本地土猪为一个类群，藏猪、环江香猪和巴马香猪为一个类群。根据《中国猪品种志》(《中国家畜家禽品种志》编委会，《中国猪品种志》编写组，1986)，巴马香猪和环江香猪同属于华南型香猪，藏猪属于高原型地方猪，均属于小型猪。说明通过UPGMA聚类能很好地区分不同品种的猪。在小型猪类群中，巴马香猪聚为一类，而藏猪和环江香猪聚为一类。可以看出巴马香猪因其特殊的封闭式近亲繁殖方式使得其分化程度低，从发育树中可以看到未鉴别的C’与巴马香猪聚为一类，与上述的指纹图谱中得到的结果一致，可以判定C’为巴马香猪肉样，也说明引物53能够有效地鉴别巴马香猪与其他4种猪。

2.2 用线粒体基因区别巴马香猪和藏猪

ISSR分子标记的PCR扩增电泳图谱中，与巴马香猪相比，藏猪的1 300 bp左右的特异性条带比较模糊。为了进一步鉴别巴马香猪与藏猪，将NCBI数据库中巴马香猪和藏猪线粒体基因进行初步比对，与巴马香猪相比，藏猪在简短重复序列的重复数量上有差异。针对该差异设计引物扩增线粒体基因组的差异位点，扩增的片段为线粒体基因组第663至第1 489位碱基，片段大小约800 bp。扩增产物由Invitrogen公司直接测序比对，结果如表3所示。研究发现，在扩增的区域中，与巴马香猪比较，藏猪具有特异的短串联重复序列“TGTGTACGCA”(图3)。因此，可以利用此差异位点区分藏猪与巴马香猪。

图2 ISSR分析中5种猪肉的UPGMA聚类分析Fig. 2 Cluster analysis of the ISSR band patterns of pork of different breed with Quantity One software表3 线粒体基因组差异位点Table 3 Loci difference in mtDNA

样品重复片段位置长度/bp重复数重复序列A1444～6971025CGTGTACGCAA2457～7191026CGTGTACGCAA3455～6971024CGTGTACGCAA4456～7221026CGTGTACGCAA5455～7111025CGTGTACGCAD1587～645106TGTGTACGCA456～7191020CGTGTACGCAD2586～646106TGTGTACGCA457～7001018CGTGTACGCA

3 讨论

巴马香猪为珍稀的地方优势品种猪，2005年国家质量监督检疫总局发布公告，宣布巴马香猪为国家地理标志产品并实施保护。常用的屠宰指标和失水率、色泽、剪切力等肉质指标因受饲养环境和生物

个体差异不能可靠地鉴定巴马香猪品种。DNA分子标记技术可以反映物种分子水平上的差异，而现有的对巴马香猪的研究主要集中在遗传多态性的分析。吴丰春等(2000)对巴马小型猪群体结构进行的随机扩增多态DNA分析显示，广西巴马小型猪个体间相似系数为0.78～0.96，其多态性频率仅为27.7%，显著低于一般品种猪的水平。说明巴马小型猪个体的选育程度和个体相似程度较高，具有较好的遗传一致性和遗传稳定性。刘中禄等(2001)应用PCR-RFLP、PCR-SSCP和PCR直接测序对中国3种实验用小型猪(西双版纳近交系小耳猪、广西巴马小型猪和贵州小型猪)线粒体DNA D-loop多态性分析观察单链构象多态性和序列多态性，发现3种猪之间mtDNA多态性贫乏，说明其亲缘关系近且母系起源进化上具有一致性，因此上述方法不能作为3种实验用小型猪品种品系的鉴定依据。

DNA分子标记技术中，ISSR分子标记已被证明是分析基因多样性的一种高效、经济的方式，现已广泛应用于种类鉴定和遗传关系分析。ISSR分子标记在种类鉴定方面与其在植物研究中的应用相比，在动物中特别是哺乳动物的研究中还处于起步阶段(林杰君等，2012)。何榆林等(2014)利用ISSR分子标记鉴定陆川猪及其肉制品中筛选出3个ISSR引物能够鉴别陆川猪和巴马香猪，与本实验有相似之处，但没有进一步研究巴马香猪与其他猪品种的鉴别方法。本研究选择了不同的小型猪样本(巴马香猪、环江香猪、藏猪)和普通猪样本(巴马本地土猪和成华猪)，从55条ISSR引物中成功筛选出1条有效引物能够鉴别巴马香猪和其他4种猪。通过聚类分析发现，普通猪样本聚为一类，而小型猪样本聚为一类，因此UPGMA聚类分析能够有效地验证ISSR扩增结果。综上所述，结合ISSR分子标记和线粒体基因分析可快速准确地鉴定巴马香猪、环江香猪、藏猪、巴马本地土猪和成华猪。研究结果对保障巴马香猪品种纯正，规范巴马香猪市场和推动巴马香猪产业化进程有重要意义，同时有助于巴马香猪养殖开发标准化体系的建立。ISSR分子标记成功鉴别巴马香猪有利于调动地方保种的积极性，并为我国珍稀猪品种遗传资源的保护工作提供参考。

图3 巴马香猪与藏猪线粒体基因短串联重复序列比较Fig. 3 Comparison of tandem repeat sequence between Bama miniature pig and Tibetan pig

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Species Authentication of Bama Miniature Pig through Inter-simple Sequence Repeat

JIN Yulan1， LI Wanli2， LI Song2， LI Xiyang2， YANG Yang2， CHEN Qiuhong3， SUN Qun2*

(1. College of Light Industry， Textile and Food Engineering， Sichuan University， Chengdu 610064，China;2. College of Life Sciences， Key Laboratory of Bio-resource and Eco-environment of Ministry of Education， Sichuan University，Chengdu 610064， China; 3. Guangxi Zhuang Autonomous Region for Analysis and Test Research， Nanning 530022， China)

In this study， species identification of Bama miniature pig was carried out by DNA fingerprinting of meats from Tibetan pig， Huanjiang miniature pig， Bama native pig， and Chenghua pig through inter-simple sequence repeat (ISSR) and mitochondrial DNA (mtDNA) analysis. One clear and repeatable primer pair named No. 53 was selected from 55 primers， which successfully separated Bama miniature pig from the other four pigs. To further differentiate Bama miniature pig and Tibetan pig， specific tandem repeat sequence of Tibetan pig ‘TGTGTACGCA’ was found out in the mtDNA. According to the results of ISSR and UPGMA cluster analysis， primer No. 53 was able to attribute to the identification of the five different pigs and one unknown pig. Therefore， ISSR coupled with UPGMA and mtDNA analysis represented an effective tool in species identification.

Bama miniature pig; identification; mitochondrial gene; inter-simple sequence repeat (ISSR)

10.11984/j.issn.1000-7083.20160017

2016-01-11 接受日期：2016-04-05 基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目(12118011-2B)

金玉兰(1992—)， 硕士， 主要研究领域为食品科学， E-mail:jin199271@126.com

*通信作者Corresponding author， 女， 教授， 博士， 研究方向为食品安全， E-mail:qunsun@scu.edu.cn

Q959.8； Q78

A

1000-7083(2016)04-0569-05