超声提取乌纠黄酮的工艺优化

李春荣，孟铁宏，罗亚男，姜艳萍，任竹君，杨 勤

（黔南民族医学高等专科学校，贵州都匀558003）

超声提取乌纠黄酮的工艺优化

李春荣，孟铁宏＊，罗亚男，姜艳萍，任竹君，杨 勤

（黔南民族医学高等专科学校，贵州都匀558003）

为合理开发利用乌纠，获得较多的乌纠黄酮，采用超声波辅助法提取苗药乌纠中的黄酮，并利用响应曲面法设计试验确定苗药乌纠中黄酮的最佳提取工艺条件。结果表明：在乙醇体积分数65%，提取时间90min，提取温度72℃，液料比33∶1（mL∶g）条件下，乌纠黄酮的溶出率达1.28%，RSD为1.13%。

乌纠；黄酮；超声；响应面法；提取工艺

乌纠，又名九倒生、地柏枝、铁郎鸡，为铁角蕨科铁角蕨属植物变异铁角蕨（Aspleniumvarians Wall.ex Hook.et Grev.）的全草，主要分布在我国西南地区海拔650～3 500m的林下潮湿岩石上或岩壁上，《中华本草·苗药卷》《中药大辞典》《中国苗族药物彩色图集》和《贵州民间药物》等医药著作对其均有记载［1］。乌纠性凉，味微苦，具有活血消肿、止血生肌的作用，乌纠可内服，也可外用，已成为贵州苗族传统的民间药用植物［2］。

黄酮类化合物是一类具有良好生理及药理功能的物质，在降血脂、抗心肌缺血、抗肿瘤、抑菌等方面具有良好的药效。大量研究表明，铁角蕨科药用植物中多数富含黄酮类化合物，在医药领域具有广阔的应用前景。目前，胡成刚等［3］研究了黔产铁角蕨科药用植物资源的种类及分布；杨鑫宝等［4］对铁角蕨科植物过山蕨的化学成分及药理活性进行了研究；李宁等［5-6］报道，过山蕨中含有丰富的黄酮类物质和过山蕨酸；张春椿等［7］对乌蕨中总黄酮类成分的提取工艺进行了研究。至今为止，仅有对乌纠止血活性部位进行筛选的报道［8］，对乌纠化学成分分析的报道较少，未见有关乌纠中黄酮类化学成分的分析及提取工艺的研究报道。为合理开发利用乌纠，获得较多的乌纠黄酮，笔者利用超声波辅助提取技术，在单因素试验的基础上，采用曲面响应面法优化黄酮提取工艺，并通过Design-Expert8.0.6.0软件进行数据拟合［9］，优化超声波辅助提取乌纠中黄酮的工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料

供试植物：乌纠采自贵州黔南、黔东南苗族地区，经贵阳中医学院鉴定为铁角蕨科铁角蕨属植物变异铁角蕨。芦丁标准品购于上海圻明生物科技有限公司（批号：KB140211），氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝和无水乙醇均为分析纯。

仪器：cary100紫外-可见分光光度计（美国），Mettler AE 240电子天平（瑞士），MU5100DUVFR实验室超纯水系统（上海淼康实业有限公司），DHG-9240A型真空干燥箱（上海金山公司）。

1.2 标准曲线的绘制

在氢氧化钠和亚硝酸钠存在的条件下，黄酮与金属Al3＋能够生成稳定的络合物。以芦丁为标准品，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法在510nm处测其吸光度，以浓度对吸光度绘制标准曲线［10-11］。芦丁标准品浓度C（mg/L）在一定范围内与吸光度A呈良好的线性关系，得线性回归方程：A＝0.013 3C＋0.00 42，线性回归系数R2＝0.999 3。

1.3 乌纠黄酮含量的测定

将乌纠植株洗净晾干后在105℃下进行烘干，粉碎，过80目筛。准确称取一定量的乌纠粉末于100mL圆底烧瓶中，然后加入一定量浓度已知的乙醇溶液，置于恒温水浴锅中，加热回流，提取完毕后，冷却，抽滤，滤液即为乌纠中的黄酮提取液，准确量取一定量的乌纠提取液于10mL的容量瓶中，按1.2中的操作方法测定吸光度，并计算黄酮提取率。

1.4 单因素试验考察

参照文献［12-13］的方法对影响乌纠黄酮提取的因素进行考察。

1.4.1 乙醇体积分数 称取1.0g乌纠固体粉末于100mL圆底烧瓶，固定乙醇和乌纠粉末的液料比为30∶1（mL∶g，以下用mL/g表示），以不同体积分数的乙醇液（40%，50%，60%，70%，80%，90%）为提取剂，在70℃下，提取90min。

1.4.2 液料比 称取1.0g乌纠固体粉末于100mL圆底烧瓶，分别按液料比为10mL/g、20mL/g、30mL/g、40mL/g、50mL/g和60mL/g加入60%的乙醇于70℃下提取90min。

1.4.3 提取温度 称取1.0g乌纠固体粉末于100mL圆底烧瓶，加入60%的乙醇溶液30mL，在不同温度（40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃）下提取90min。

1.4.4 提取时间 称取1.0g乌纠固体粉末于100mL圆底烧瓶，加入60%的乙醇溶液30mL，在90℃下分别提取30min、60min、90min、120min和150min。

1.5 乌纠中黄酮提取工艺的响应曲面优化

根据单因素试验结果，参照文献［14］的方法，采用响应曲面法中设计4因素3水平共29组试验（表1）。

表1 超声提取乌纠黄酮的响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design for extracting flavonoids fromW.jiub

1.6 回归模型的建立

以黄酮提取率（y）为响应值，RSM软件程序对响应面试验结果进行分析，建立二次多项式模型［15］。

1.7 响应面分析

根据回归方程绘出等高线图、3D响应面图，从响应面图观察各独立变量之间的交互作用对响应值的影响，分析乙醇体积分数、液料比、提取温度及提取时间对乌纠黄酮提取率影响的交互作用。

2 结果与分析

2.1 不同提取条件下乌纠黄酮的提取率

2.1.1 乙醇体积分数 由图1A可知，黄酮的提取得率随乙醇体积分数的增大而增加，当乙醇体积分数达60%时，黄酮的提取得率达最大，为1.09%，继续增大乙醇的体积分数，黄酮的提取得率不再增加，甚至减少。其原因可能是乌纠中一些色素等醇溶性杂质的溶出性能在高浓度乙醇溶液中被激活，在溶液中与黄酮发生竞争反应从而导致黄酮提取率下降。因此乙醇浓度以60%左右为宜。

2.1.2 液料比 由图1B可知，乌纠中黄酮的提取率随液料比的增加而升高，当液料比达30mL/g时，提取率达最大，为1.09%；继续提高液料比，乌纠中黄酮提取率略显下降直至平缓。一般情况下，提取剂用量越大，黄酮类物质越易溶出，而乌纠中黄酮提取率略显下降，可能是乌纠中其他杂质等随着提取溶剂的增加也逐渐析出，从而干扰了黄酮的测定，当黄酮溶出达最大时，继续增大提取溶剂，也增加了成本。综合考虑，提取液料比以30mL/g左右为宜。

2.1.3 提取温度 由图1C可知，黄酮的提取率受温度影响比较明显，随温度升高呈先增大后减小，当温度达70～80℃时，黄酮提取率达最大，为1.09%。通常情况下，升高温度可以使分子的热运动速率加快，有利于溶质分子由固相向液相转移，乌纠中黄酮的提取率升高。如果温度过高，黄酮中一些对热不稳定的化合物也容易被氧化，从而导致黄酮提取率的下降，且升高温度也会消耗时间和能量。综合考虑，温度以70℃左右为宜。

2.1.4 提取时间 从图1D可知，乌纠中黄酮的提取率随时间的延长呈先增后减趋势。这可能是提取出的黄酮在空气中发生氧化反应或者被分解，因此造成黄酮提取率下降。甚至乌纠中的一些糖类或有机酸类等杂质成分也会在长时间的提取中溶出，因此提取时间以90min左右为宜。

图1 不同提取条件下乌纠黄酮的提取率Fig.1 Extraction rate of flavonoids fromW.jiubunder different extraction condition

2.2 乌纠黄酮最佳提取工艺的优化

2.2.1 回归模型的建立与分析 由表2可知，超声提取乌纠黄酮响应面试验各处理的黄酮提取率。通过分析，得乌纠中黄酮提取率（y）对乙醇体积分数（A）、液料比（B）、提取温度（C）和提取时间（D）的二次多项回归模型：

对所得模型进行显著性检验，总模型方程的P＜0.01，表明回归模型极显著，回归系数R2＝0.972 9，即回归方程对试验的拟合度较好［16］。其校正决定系数RAdj＝0.945 9，试验误差较小；失拟项P＝0.315＞0.05，表明模型失拟度不显著，其失拟项可取，表中给出的模型预测值和实际值之间较为吻合，线性相关性良好，不存在显著差异。回归方程模型的二次项极显著，但交互项中AB、BC和CD项不显著，AC和BD交互作用显著，AD项的交互作用极显著。A、B、C、D的F值分别为94.19、63.56、97.59和21.9，对黄酮提取影响依次为提取温度＞乙醇体积分数＞液料比＞提取时间。

表2 超声提取乌纠黄酮的曲面响应试验设计结果Table 2 Results of Box-Behnken design for extracting flavonoids fromW.jiub

2.2.2 不同因素间的交互作用 响应曲面变化陡峭，说明有交互作用的2个因素之间的交互作用强，也说明曲面的响应值对条件的改变越敏感，对乌纠中黄酮的提取率影响也越显著。平缓的响应曲面说明各个影响因素的交互作用较弱，对黄酮提取率的影响不显著。由图2可知，在各个因素的交互作用中，提取温度与乙醇体积分数的交互作用最强，对乌纠中黄酮提取率的影响最显著，提取时间与体积分数以及提取时间与料液比的交互作用也比较强，对黄酮提取率影响显著。而料液比与体积分数、提取温度与料液比、提取时间与温度之间的交互作用不明显。综合分析，在不断增加乙醇的体积分数，延长提取时间的过程中，黄酮的提取率逐渐升高，当达最高值时，继续增加乙醇体积分数和延长提取时间，黄酮的提取率反而下降。由此可知，在选择合适的乙醇体积分数和恰当的提取时间前提下，即使料液比和温度不太高时，也能达到较高的提取率。

图2 不同因素交互作用的乌纠黄酮提取率Fig.2 Flavonoids extraction rate fromW.jiubunder interactions between different factors

2.2.3 最佳工艺及验证 利用软件Design expert对回归模型方程进行计算，得到黄酮提取的最佳工艺条件为乙醇体积分数64.95%，提取时间90.08min，提取温度72.14℃，液料比33.54∶1（mL/g），在此条件下，黄酮的溶出率为1.172 8%。为便于试验操作，对最佳工艺条件进行修正为乙醇体积分数65%，提取时间90min，提取温度72℃，液料比33∶1（mL/g）。对最佳工艺条件进行3次平行验证试验，乌纠中黄酮的溶出率为1.28%，RSD为1.13%。

3 结论与讨论

采用超声波辅助提取方法提取乌纠中的总黄酮，并对黄酮类化合物的含量进行测定，采用曲面响应法优化黄酮的提取工艺，其最佳工艺条件为乙醇体积分数65%，提取时间90min，提取温度72℃，液料比33∶1（mL/g），在该条件下，黄酮的溶出率达1.28%，RSD为1.13%。乌纠作为贵州苗族地区民间传统药用植物，其所含有的黄酮类化合物成分在抑菌、抗肿瘤、降血脂和抗心肌缺血等方面有显著的药效，在未来民族医药的开发中具有广阔的应用前景。采用超声波辅助提取技术结合响应面分析法可节省提取溶剂和减少对环境的污染，对有效成分的破坏性小，数学模型的拟合度高，试验结果具有较大的参考价值，是一种值得提倡的提取方法。

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（责任编辑：孙小岚）

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Technology of Flavonoids fromWetjiub

LI Chunrong，MENG Tiehong＊，LUO Yanan，JIANG Yanping，REN Zhujun，YANG Qin
（QiannanMedicalCollegeforNationalities，Duyun，Guizhou558003，China）

The ultrasonic-assisted extraction technology is used in extracting flavonoids fromW.jiuband the optimum extraction conditions are determined by the response surface method to rational develop and utilizeW.jiuband obtain more flavonoids fromW.jiub.Results：The dissolution rate of flavonoids fromW.jiubis 1.28%with 1.13%RSDunder the optimum extraction conditions of 65%ethanol content，90min，72℃and 33∶1（mL∶g）of liquid-solid ratio.

Wetjiub；flavonoids；ultrasound；response surface method；extraction technology

S567.9；O629.9

A

2016-03-09；2016-08-31修回

贵州省卫生厅校科技联合基金项目“苗药乌纠止血活性部位研究”（Gzwkj2012-2-018）；黔南民族医学高等专科学校基金项目“瓜环对苗药乌纠中黄酮类成分芦丁的缓释性研究”（QNYZ201510）；黔南州科技计划项目“六元瓜环对苗药乌纠中黄酮类成分芦丁的缓释性研究”［黔南州科合社字（2015）2］

李春荣（1983-），女，副教授，从事化学教学及天然产物研究。E-mail：lichunrong68＠163.com

＊通讯作者：孟铁宏，E-mail：mengtiehong19850＠163.com

1001-3601（2016）09-0401-0132-05