HPLC同时测定刺梨中2种三萜成分

李齐激，南 莹，杨 艳，王道平，杨小生

（贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550002）

HPLC同时测定刺梨中2种三萜成分

李齐激，南 莹，杨 艳，王道平，杨小生＊

（贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550002）

为同时测定刺梨中2种三萜成分，采用高效液相色谱法同时测定刺梨中蔷薇酸、1-β羟基蔷薇酸含量，并对贵州不同地方的刺梨进行测定。结果表明：1）在PntulipsTM BP-C18色谱柱（4.6mm× 250mm，5μm），乙腈-0.05%三氟醋酸水溶液（40∶60）为流动相，柱温30℃，流速1mL/min，检测波长208nm，进样量为10μL的条件下，蔷薇酸和1-β羟基蔷薇酸分别在0.268～1.608μg和0.027～0.162μg线性关系良好（r＞0.999 7），精密度RSD分别为0.53%和1.36%，重复性RSD分别为2.12%和0.76%，12h内稳定性RSD分别为1.58%和1.88%，平均回收率分别为100.20%和98.79%，RSD分别为0.76%和2.37%，该方法操作简便准确，可用于同时测定刺梨中蔷薇酸、1-β羟基蔷薇酸的含量。2）遵义产刺梨中的蔷薇酸含量较高，为1.31%；龙里产刺梨中的蔷薇酸、1-β羟基蔷薇酸的含量相对稳定，分别为1.26%和0.15%。

刺梨；蔷薇酸；1-β羟基蔷薇酸；高效液相色谱

刺梨（RoseroxburghiiTratt）系蔷薇科植物缫丝花的果实，是具有维C之王美誉的药食两用植物，先后收载于1994版、2003版《贵州省中药材、民族药材质量标准》和2004年卫生部食品新资源品种17号公告，于2012年7月被国家质检总局（2012年第102号公告）批准为地理标志保护产品，广泛分布于暖温带及亚热带地区，我国主要分布于西南地区，尤以贵州资源较为丰富［1-3］。其具有消食健脾，收敛止泻的功效，主要用于治疗积食腹胀及泄泻等疾病［4］。研究发现，该植物主要含有蔷薇酸、1-β羟基蔷薇酸等三萜成分及黄酮类成分，在抗氧化、抗癌防癌、调节机体免疫功能、延缓衰老和解毒镇静等方面均具有较好的治疗或预防作用［5-6］。虽然刺梨作为药食两用植物收载相关标准已有时日，但截此目前关于刺梨的质量标准检测方法仍以显微鉴别与薄层层析法为主［4］，含量测定主要集中在维生素C及氨基酸等营养成分［7-9］，针对刺梨单一活性三萜成分的测定方法未见报道。为此，笔者结合课题组前期化学物质基础研究，综合考虑相关影响因素选择其中较具有代表性的2个三萜成分，建立同时测定其含量的高效液相色谱法，以期为该植物药材及其新产品品质评价与质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

刺梨，于2015年9月采自贵州黔南布依族苗族自治州龙里县、兴义市兴仁县、凯里市郊、贵阳市花溪区及开阳县、遵义市南白镇和鸭溪镇，经贵州大学鉴定为蔷薇科植物缫丝花的果实（刺梨），标本（凭证201509001）保存于贵州省、中国科学院天然产物化学重点实验室。蔷薇酸、1-β羟基蔷薇酸对照品为实验室自制，经NMR、MS等光谱数据确定其化学结构，通过HPLC纯度检测均大于98.0%；乙腈为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司），三氟醋酸为分析纯（天津市光复精细化工研究所），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

Agilent 1100高效液相色谱（含柱温箱、可见-紫外检测器、四元泵、在线脱气机和自动进样器），美国安捷伦科技有限公司；电子天平，Mettler Toledo，26115102-0；旋转蒸发仪，瑞士BUCHI公司；ZK-82A型真空干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 对照品溶液的制备

精密称取蔷薇酸、1-β羟基蔷薇酸对照品适量，分别置于10mL、100mL量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，制成每1mL含蔷薇酸1.34mg/mL、1-β羟基蔷薇酸0.135mg/mL的对照品储备液。精密量取各储备液1mL，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得。

1.3 供试品溶液的制备

取刺梨粗粉（过三号筛）约1g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加75%乙醇100mL，水浴回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，减压浓缩近干，加适量蒸馏水溶解，再用乙酸乙酯萃取3次（体积比为1∶2），合并乙酸乙酯萃取层，减压浓缩近干，立即加甲醇使溶解，转移至100mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得［10-11］。

1.4 色谱条件筛选

以PntulipsTM BP-C18色谱柱（4.6mm× 250mm，5μm），柱温30℃，流速1mL/min，检测波长208nm，进样体积10μL为基础，对不同比例流动相（甲醇∶水＝30∶70、乙腈∶水＝40∶60、甲醇∶乙酸水溶液＝50∶50、乙腈∶乙酸水溶液＝60∶40、甲醇∶三氟醋酸水溶液＝70∶30、乙腈∶三氟醋酸水溶液＝80∶20）下样品与对照物质色谱峰分离度进行考察，以筛选出最佳色谱条件。

1.5 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液2.0μL、4.0μL、6.0μL、8.0μL、10.0μL和12.0μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积（y）为纵坐标，进样量（x，mg）为横坐标绘制标准曲线。

1.6 方法学考察

1.6.1 精密度 精密吸取对照品溶液适量，按筛选的最佳色谱条件重复进样6次，记录峰面积，计算峰面积RSD。

1.6.2 重复性 称取同一刺梨样品6份，制备供试品溶液，按筛选的最佳色谱条件分别进样，记录峰面积，计算峰面积RSD。

1.6.3 稳定性 取同一刺梨供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、10h和12h时按筛选的最佳色谱条件分别进样测定，记录峰面积，计算峰面积RSD。

1.6.4 加样回收率 称取已知含量的刺梨样品6份，每份约0.5g，分别加入蔷薇酸6.05mg、1-β羟基蔷薇酸0.63mg，制备供试品溶液，再按筛选的最佳色谱条件分别进样测定，计算回收率。

1.7 样品的测定

取贵州各产地刺梨样品约1g，平行制备供试品溶液各2份，再按筛选的最佳项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算样品中蔷薇酸、1-β羟基蔷薇酸平均含量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的流动性选择

由图示可知，在PntulipsTM BP-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），乙腈-0.05%三氟醋酸水溶液流动相（40∶60），柱温30℃，流速1mL/min，检测波长208nm及进样体积10μL条件下，各样品峰与其他杂质峰能够得到很好的分离，分离度均大于1.5。

2.2 标准曲线线性范围与回归方程

试验表明，刺梨蔷薇酸和1-β羟基蔷薇酸的回归方程分别为y＝237.26x-50.32（R＝0.999 8）、y＝222.36x-1.829 4（R＝0.999 7）。在0.268～1.608μg和0.027～0.162μg线性关系良好。

2.3 方法学考察

精密度：蔷薇酸和1-β羟基蔷薇酸的峰面积RSD分别为0.53%和1.36%，表明仪器精密度良好。重复性：蔷薇酸和1-β羟基蔷薇酸的峰面积RSD分别为2.12%和0.76%，表明该方法重复性良好。稳定性：蔷薇酸和1-β羟基蔷薇酸的峰面积RSD分别为1.58%和1.88%，表明供试品在12h内稳定性良好。加样回收率：由表1可知，蔷薇酸、1-β羟基蔷薇酸平均加样回收率分别为100.20%和98.79%，RSD分别为0.76%和2.37%，表明测定方法准确、可行。

2.4 样品测定

由表2可知，除遵义产刺梨中的蔷薇酸含量（1.31%）较高外，龙里产刺梨中蔷薇酸、1-β羟基蔷薇酸的含量相对稳定，分别为1.26%和0.15%，其他靠近龙里区域产刺梨中二者的含量也更接近龙里产刺梨，远离则相对偏低，甚至消失，如兴义兴仁产刺梨中二者含量分别为0.87%和0，此现象或受当地环境变化及过度开发影响。

图示 刺梨中1-β羟基蔷薇酸和蔷薇酸对照品（A）与供试品（B）HPLC色谱Fig. HPLC Chromatogram of 1-β-hydroxy euscaphic acid and euscaphic acid in CK（A）and sample（B）

表1 蔷薇酸和1-β羟基蔷薇酸的回收率（n＝6）Table 1 Recovery rate of 1-β-hydroxy euscaphic acid and euscaphic acid（n＝6）

表2 贵州不同地方刺梨的蔷薇酸和1-β羟基蔷薇酸含量（n＝6）Table 2 Content of 1-β-hydroxy euscaphic acid and euscaphic acid inR.roxburghiifrom different producing areas in Guizhou（n＝6）%

3 结论

随着刺梨作为药食两用植物正逐渐被人们广泛关注，大量以刺梨为原料的健康产品不断涌现（如刺梨干、刺梨酒、刺梨醋、刺梨口服液、刺梨胶囊等），因其是卫计委公布的食品新资源，针对该品种的质量控制方法相对滞后。基于贵州丰富的刺梨资源亟待开发利用和广泛的市场需求，笔者在前期研究基础上，通过综合考虑检测指标的代表性、质量控制方法的难易程度和地方标准修订需要［4-5］，选择蔷薇酸、1-β羟基蔷薇酸作为检测指标进行质量控制方法的建立与含量测定，结果表明，在PntulipsTM BP-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），乙腈-0.05%三氟醋酸水溶液（40∶60）为流动相，柱温30℃，流速1mL/min，检测波长208nm，进样量为10μL的条件下，蔷薇酸、1-β羟基蔷薇酸分别在0.268～1.608μg和0.027～0.162μg线性关系良好（R＞0.999 7），精密度RSD分别为0.53%和1.36%，重复性RSD分别为2.12%和0.76%，12h内稳定性RSD分别为1.58%和1.88%，平均回收率分别为100.20%、98.79%，RSD分别为0.76%、2.37%。对贵州地区刺梨中2种三萜成分进行测定，遵义产刺梨中蔷薇酸含量较高，为1.31%；龙里产刺梨中的蔷薇酸、1-β羟基蔷薇酸的含量相对稳定，分别为1.26%和0.15%。黔中、黔北地区相对更适合刺梨生长，在品种选育时，可结合刺梨中三萜成分的含量和该地区土壤环境进行综合考虑，以此提高刺梨品种质量。

［1］中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京：科学出版社，1998.

［2］贵州植物志编辑委员会.贵州植物志［M］.贵阳：贵州人民出版社，1982.

［3］陈稠彪.做大贵州刺梨产业打造天赐“维C之王”［J］.中国林业，2014（16）：22-23.

［4］贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准［M］.贵阳：贵州科学技术出版社，2003：230.

［5］杨小生，马 琳，梁 冰，等.刺梨果活性提取物及其制备方法、检测方法和应用：中国，ZL201110080922［P］.2013-03-20.

［6］代甜甜，杨小生.刺梨化学成分及药理活性研究进展［J］.贵阳中医学院学报，2015，37（4）：93-97.

［7］李春荣，孟铁宏，刘仕云，等.高效液相色谱法测定黔产野生刺梨干中VC含量［J］.食品工业，2014，35（8）：271-273.

［8］吴洪娥，金 平，周 艳，等.刺梨与无籽刺梨的果实特性及其主要营养成分差异［J］.贵州农业科学，2014，42（8）：221-223.

［9］鲁 敏，安华明，赵小红.无籽刺梨与刺梨果实中氨基酸分析［J］.食品科学，2015，36（14）：118-121.

［10］秦晶晶，李齐激，薛琰，等.刺梨总三萜提取方法及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究［J］.食品工业科技，2014（10）：186-189.

［11］南 莹，李齐激，马 琳，等.紫外分光光度法测定刺梨总三萜与总黄酮含量［J］.遵义医学院学报，2012，35（6）：473-476.

（责任编辑：孙小岚）

Simultaneous Determination of Two Triterpenoids Components fromRoseroxburghiiby HPLC

LI Qiji，NAN Yin，YANG Yan，WANG Daoping，YANG Xiaosheng＊
（KeyLaboratoryofChemistryforNaturalProducts，ChineseAcademyofSciences，Guiyang，Guizhou550002，China）

In order to simultancous detemination of two triterpenoids compents fromR.roxburghil，The content of 1-β-hydroxy euscaphic acid and euscaphic acid inR.roxburghiifrom different producing areas in Guizhou was determined by HPLC.Results：1）The content of euscaphic acid and 1-β-hydroxy euscaphic acid inR.roxburghiiis 0.268～1.608μg and 0.027～0.162μg with a good linear relation（r＞0.999 7）under the conditions of Pntulips TM BP-C18（4.6mm×250mm，5μm）column with acetonitrile-water（containing 0.05%Trifluoroacetic acid）as mobile phase，30℃，1mL/min of flow rate，208nm and 10μL of sample size.TheRSDof precision，repetition and stability within 12hof euscaphic acid and 1-βhydroxy euscaphic acid is 0.53%and 1.36%，2.12%and 0.76%1.58%and 1.88%respectively.The average recovery rate of euscaphic acid and 1-β-hydroxy euscaphic acid is 100.20%and 98.79%and theRSDis 0.76%and 2.37%.The determination method with advantages of easy operation and accuracy can be used to determine euscaphic acid and 1-β-hydroxy euscaphic acid content inR.roxburghiisimultaneously.2）The euscaphic acid content inR.roxburghiifrom Zunyi is the highest（1.31%）.The euscaphic acid and 1-β-hydroxy euscaphic acid content inR.roxburghiifrom Longli County is 1.26%and 0.15%respectively and their content is relatively stable.

Roseroxburghii；euscaphic acid；1-β-hydroxy euscaphic acid；HPLC

R284.1

A

2016-02-19；2016-08-29修回

贵州省农业科技攻关重点项目“药渣高值化综合利用关键技术研究与示范”［黔科合NY（2015）3005-1］；贵州省科技重大专项“刺梨高值化新产品研制及示范—刺梨活性提取物的新产品研发”［黔科合重大专项字（2013）6006-4］；贵州省创新人才培养计划项目“贵州省高层次创新型人才培养—百层次”［黔科合人才（2015）4027］；贵州省创新人才团队建设项目“贵州省药材品质研究与评价科技创新人才团队”［黔科合人才团队（2013）4006］

李齐激（1983-），男，助理研究员，从事民族药用植物资源化学研究。E-mail：leeqiji＠163.com

＊通讯作者：杨小生（1966-），男，研究员，从事民族药用植物资源化学及其品质评价研究。E-mail：gzcnp＠sina.cn

1001-3601（2016）09-0399-0125-04