贵州不同产地铁皮石斛的单糖组成

谭 丹，杨传玉，胡 珺，陈思颖，杨 畅，孙 佳，兰燕宇＊

（1.贵州医科大学药学院，贵州贵阳550004；2.民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳550004；3.贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳550004）

贵州不同产地铁皮石斛的单糖组成

谭 丹1，2，杨传玉1，2，胡 珺1，2，陈思颖1，3，杨 畅1，3，孙 佳1，3，兰燕宇1，2＊

（1.贵州医科大学药学院，贵州贵阳550004；2.民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳550004；3.贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳550004）

为铁皮石斛药效及多糖药理活性提供科学依据，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化方法使糖类物质带上紫外基团，用高效液相色谱仪紫外检测器进行检测，对贵州不同产地铁皮石斛单糖组成进行测定，并对其中单糖的含量进行分析。结果表明：铁皮石斛多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和半乳糖等组成，其中甘露糖和葡萄糖含量较高，甘露糖均占总多糖35%以上，葡萄糖均占总多糖12%以上，贵州不同产地铁皮石斛药材中各单糖占总多糖含量的比例存在明显差异，大方县产铁皮石斛单糖含量相对较低，而乌当及独山等地产铁皮石斛单糖含量相对较高。

柱前衍生化；铁皮石斛；单糖；组成；贵州

铁皮石斛为兰科石斛属植物铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimura et Migo）的干燥茎，又名黑节草，为我国传统名贵药材，以新鲜或干燥的茎入药，有味甘、质重、黏性大等特点，享有中华九大仙草之首的美誉；《神农本草经》将其列为上品，有滋阴清热、益胃生津，润肺止咳等功效，主治热病伤津、口干烦渴、病后虚热、目暗不明、萎缩性胃炎、浅表性胃炎、慢性结肠炎等症［1-2］。中国的铁皮石斛主要分布在浙江、广西、云南、贵州等省区［3-5］，由于以铁皮石斛为主要原料的产品不断问世，对铁皮石斛原料需求急剧增加，其野生资源短缺的矛盾日益突出，具有巨大的市场需求。

药理学研究表明，铁皮石斛多糖具有免疫调节、保肝护胃和降压降血糖等的生物活性，为铁皮石斛主要药效成分［6-8］，而多糖糖链的一级结构与其活性密切相关，一级结构的研究主要体现在组成多糖的单糖种类及各单糖的组成比例［9-10］。因此，弄清铁皮石斛多糖的单糖组成对控制多糖质量标准及研究铁皮石斛药理活性具有重要意义。因单糖存在互变异构体、差向异构体、结构相似等特征，而且往往同一待测样品，如多糖、糖蛋白等，可能含有许多类型的单糖，所以单糖分析有其自身的特点，必须具有高效的分离技术，方可实现系列单糖的有效分离［11］。单糖在紫外区并无吸收［12］，故采用柱前衍生化方法使糖类物质带上紫外基团，用HPLC紫外检测器进行检测，具有分离效率高、分析时间短、进样量少等特点。为有效、快速地测定铁皮石斛中的单糖，建立铁皮石斛多糖水解物PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生化方法测定贵州不同产地铁皮石斛中单糖的组成，以期为铁皮石斛药材的区域选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

铁皮石斛：收集贵州省8个不同种植基地的铁皮石斛药材共20批，其中，贵阳市乌当区6批，独山基地5批，铜仁市1批，大方县5批，贵阳市白云区1批，罗甸县1批，余庆县1批。

试剂：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，99%，aladdin），三氟乙酸（TFA，化学纯，国药集团化学试剂有限公司，20140212），D-甘露糖（A0253685，＞99%），半乳糖（LL50J01，＞99%），D-无水葡萄糖（LR70H02，＞99%），半乳糖醛酸（G0010），阿拉伯糖（5328-37-0，＞98%），木糖（A0281299，＞99%），乙腈（色谱纯，德国Merck公司），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

仪器：美国戴安UltiMate3000双三元高效液相色谱仪，AE240电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（G2X-942-0MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂），EL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），实验室专用超纯水机（SC082767，四川沃特尔水处理设备有限公司），离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂），恒温水浴锅（HHS-11-1，杭州大卫科教仪器有限公司）。

1.2 铁皮石斛多糖的提取

称取铁皮石斛药材0.2g，精密称定，置于索氏提取器中，加95%乙醇适量，加热回流提取4h，弃去乙醇液，药渣挥干乙醇，滤纸筒拆开置于烧杯中，加水100mL，煎煮1h并搅拌，过滤，浓缩后60℃干燥，即得铁皮石斛多糖。

1.3 铁皮石斛多糖的水解

精密称取铁皮石斛多糖10mg于安瓿中，加入0.6mol/L三氟乙酸1mL，置于102℃烘箱内水解3h，冷却至室温，转移至5mL容量瓶中，用2mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0，加水定容至刻度即得。

1.4 铁皮石斛多糖供试品溶液的柱前衍生化

精密吸取1.2项下供试品溶液0.2mL，加入0.2mL 0.5mol/L PMP甲醇溶液和0.2mL 0.3mol/L NaOH溶液混匀，70℃水浴加热100min，并不时振摇，取出室温冷却10min，用0.3mL 0.2mol/L HCl中和，加入2mL三氯甲烷萃取，萃取2次，充分振摇，取上层水相，加水补足至1mL，混匀，离心10min，即得。

1.5 色谱条件

色谱柱：CORTECS C18（150mm×4.6mm，2.7μm）；流动相：A为乙腈，B为0.02mol/L乙酸铵缓冲溶液，检测波长：250nm；流速：0.5mL/min，柱温：35℃，进样量：10μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相的梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.6 系统适用性考察

分别精密吸取混合对照品溶液（甘露糖50mg、半乳糖醛酸2mg、葡萄糖25mg、半乳糖3mg于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀后，精密量取2.5mL于10mL量瓶中，用水稀释至刻度）0.2mL和供试品溶液各0.2mL，照1.4进行柱前衍生化，并在1.5的色谱条件下，分别用HPLC测定，根据色谱参数计算系统适用性。

1.7 方法学考察

1.7.1 线性关系考察 精确称取各单糖标准品甘露糖50mg、半乳糖醛酸2mg、葡萄糖25mg、半乳糖3mg于25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀后，得对照品溶液5，从对照品溶液5中分别精密量取0.5mL、2.5mL、5.0mL、7.5mL于10mL量瓶中，用水稀释至刻度，得对照品溶液1、2、3、4。精密吸取对照品溶液0.2mL，照1.4制备PMP衍生物，然后进行测定，以进样浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归。

1.7.2 精密度试验 取贵州罗甸县（19号）铁皮石斛样品0.2g，精密称定，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样10μL，连续进样6次，测定峰面积。

1.7.3 重复性试验 取同一批号（19号）铁皮石斛样品6份，每份0.2g，精密称定，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别测定峰面积。

1.7.4 稳定性试验 照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别于0h、1h、2h、4h、8h、16h和24h进样，测定各指标成分峰面积。

1.7.5 回收率试验 精密称取铁皮石斛药材样品多糖（19号）9份，每3份为1组，分别按各单糖含量的50%、100%、150%加入4种单糖对照品，按1.3和1.4对多糖进行水解和衍生化，测定各含量。

1.8 含量测定

取铁皮石斛样品，按1.2制备铁皮石斛多糖，按1.3和1.4对多糖进行水解和衍生化处理，按1.5的色谱条件测定，记录峰面积，计算各单糖占总多糖的比例。

2 结果与分析

2.1 系统适用性考察结果

从图中看出，1号峰为衍生化试剂PMP峰，2号峰为甘露糖，3号峰为半乳糖醛酸，4号峰为葡萄糖，5号峰为半乳糖。4种单糖与其他物质峰分离完全，理论塔板数均在10 000以上。

图示 铁皮石斛多糖衍生化产物和4种单糖混合对照品液相色谱Fig. Liquid chromatogram of Dendrobium officinale polysaccharide derivatization product and the mixture sample of 4monosaccharide

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系 甘露糖在0.020 0～0.400 0mg/mL、半乳糖醛酸在0.000 8～0.016 0mg/mL、葡萄糖在0.010 0～0.200 0mg/mL、半乳糖在0.001 2～0.024 0mg/mL线性范围内均具有良好的线性（表2）。

2.2.2 精密度 4个单糖峰面积RSD依次为甘露糖0.76%、半乳糖醛酸0.82%、葡萄糖0.91%、半乳糖0.83%，表明精密度良好。

2.2.3 重复性 4个单糖峰面积RSD分别为甘露糖0.76%、半乳糖醛酸0.84%、葡萄糖0.89%、半乳糖1.20%，表明试验的重复性良好。

表2 4种单糖的标准曲线和线性范围Table 2 Standard curves and linear range of four different monosaccharides

2.2.4 稳定性 4个单糖峰面积RSD分别为甘露糖0.16%、半乳糖醛酸0.94%、葡萄糖0.95%、半乳糖0.93%，表明，室温下供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.2.5 回收率 甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和半乳糖的平均回收率和RSD分别为98.6%、101.5%、99.1%、102.4%和1.23%、0.83%、0.80%和1.34%。表明该方法准确度良好。

2.3 贵州不同产地铁皮石斛单糖的含量

从表3可知，铁皮石斛甘露糖和葡萄糖含量较高，甘露糖均占总多糖35%以上，这对多糖发挥调节免疫系统及抗炎效果具有重要作用；葡萄糖均占总多糖12%以上；半乳糖醛酸和半乳糖含量相对较低，仅占总多糖1%～4%。甘露糖以贵州独山、白云、罗甸、余庆最高，均占总多糖50%以上，而贵州大方产的含量相对较低，均占总多糖40%以下，而葡萄糖含量则以独山以及铜仁相对较低，白云、罗甸、余庆也均占总多糖20%以上，半乳糖醛酸与半乳糖含量差异不大。综合来说，以独山、白云、罗甸和余庆产地的铁皮石斛含量较高，这可能与其生长环境等有一定关系。

表3 铁皮石斛各单糖占总多糖比例（n＝2）Table 3 Proportion of different monosaccharide in total polysaccharide of Dendrobium officinale

3 结论与讨论

1）研究结果表明，铁皮石斛茎中多糖是一种酸性杂多糖，主要由3种六碳糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖），一种糖醛酸（半乳糖醛酸）和2种五碳糖（木糖、阿拉伯糖）组成。其中甘露糖和葡萄糖含量较高，甘露糖均占总多糖35%以上，葡萄糖均占总多糖12%以上。贵州不同产地铁皮石斛多糖中各单糖含量存在显著差异，贵阳乌当以及独山等地甘露糖与葡萄糖含量较高，而大方等地甘露糖与葡萄糖含量相对偏低，总体上看，单糖以甘露糖和葡萄糖含量较高。试验仅对贵州不同产地铁皮石斛的单糖组成进行测定，后续将继续收集云南、浙江和广西等不同省份铁皮石斛样品进行比较研究，扩大研究结果的应用范围，并且通过测定研究每种单糖的含量，更进一步为铁皮石斛茎多糖的组成和生物活性的研究提供基础依据，对深入开发铁皮石斛具有重要意义。

2）贵州不同产地铁皮石斛药材中糖类化合物化学组成相似，但相对比例有明显的差异，而不同植物中提取的多糖其生物活性有很大差别［10］，多糖的研究主要体现在组成多糖的单糖种类及各单糖的组成比例，因此，对铁皮石斛多糖的单糖组成进行分析具有重要意义。通过研究不同产地铁皮石斛茎多糖的单糖组成和各单糖的组成比例，可为铁皮石斛茎的多糖结构分析及其药用价值研究提供参考。

［1］李 娟，李顺祥，黄 丹，等.铁皮石斛资源、化学成分及药理作用研究进展［J］.科技导报，2011，19（18）：74-79.

［2］刘 莉，张 庭，潘 俊，等.铁皮石斛种质资源研究进展［J］.山东农业生物学报，2014，33（3）：83-87.

［3］高等植物图鉴编组.高等植物图鉴：第4册［M］.北京：科学出版社，1973.

［4］张治国.名贵中药——铁皮石斛［M］.上海：上海科学技术文献出版社，2006.

［5］包雪声.中国药用石斛［M］.上海：复旦大学出版社，2001.

［6］吴 建，王建方，方 玲，等.国内铁皮石斛研究概况［J］.中国药学杂志，2013，48（19）：1610-1613.

［7］泮玉华，王文霞，章乐建.乐清栽培的铁皮石斛其有效部位化学成分的动态研究［J］.海峡药学，2011，13（10）：82-84.

［8］王洪云，李 铭.石斛多糖的药用功能研究进展［J］.环球中医药，2014，7（10）：817-820.

［9］毛幼儿，周桂芬.基于柱前衍生化HPLC法分析铁皮石斛茎和叶多糖中甘露糖的含量［J］.江西中医学院学报，2011，23（4）：38-39.

［10］倪力军，王媛媛，何婉瑛，等.8种多糖的单糖组成、活性及其相关性分析［J］.天津大学学报，2014，47（4）：326-330.

［11］张维冰，王智聪，张凌怡，等.柱前衍生超高效液相色谱-串联四极杆质谱法测定仙草多糖组成及其含量［J］.分析测试学报，2013，32（2）：143-149.

［12］杨兵勋，沈春香，王 增，等.HPLC法测定铁皮石斛饮料中D-甘露糖的含量［J］.食品科学，2011，32（8）：275-277.

（责任编辑：孙小岚）

Monosaccharide Composition ofDendrobiumofficinalefrom Different Producing Areas in Guizhou

TAN Dan1，2，YANG Chuanyu1，2，HU Jun1，2，
CHEN Siying1，3，YANG Chang1，3，SUN Jia1，3，LAN Yanyu1，2＊
（1.SchoolofPharmacy，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang，Guizhou550004；2.TheEngineeringResearchCenterforDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTraditionalChineseMedicine，MinistryofEducation，Guiyang，Guizhou550004；3.GuizhouKeyLaboratoryofPharmaceutics，Guiyang，Guizhou550004，China）

The composition and content of monosaccharide inD.officinalefrom different producing areas in Guizhou were detected by the ultraviolet detector of HPLC after the carbohydrates are carried with ultraviolet radicals by PMP pre-column derivatization method to provide the scientific basis for pharmacological function and polysaccharide pharmacological activity ofD.officinale.Results：The polysaccharide ofD.officinaleis composed by mannose，glucose，galacturonic acid and galactose mainly.The content of mannose and glucose accounts for above 35%and 12%of total polysaccharide respectively.There is a significant difference in proportion of different monosaccharide in total polysaccharide ofD.officinalefrom different producing areas.The monosaccharide content ofD.officinalefrom Dafang County is lower relatively and monosaccharide content ofD.officinalefrom Wudang District and Dushan County is higher.

pre-column derivatization；Dendrobiumofficinale；monosaccharide；composition；Guizhou

R282.7；S657

A

2016-01-22；2016-08-28修回

贵州省中药现代化科技产业研究开发专项“黔产铁皮石斛品质评价体系研究及深加工产品开发”［黔科合SY字（2014）3032-2］；民族药与中药开发应用产学研基地建设项目［黔科合KY字（2013）122］；现代药物研究开发协同创新中心项目［黔教合协同创新字（2013）04］；贵州省民族药与中药开发应用工程技术研究中心项目［黔科合重G字（2013）4001］

谭 丹（1991-），女，在读硕士，研究方向：药物新剂型、新技术、新工艺研究与新药开发。E-maiL：845947785＠qq.com

＊通讯作者：兰燕宇（1985-），女，教授，从事中药新药研究与开发。E-maiL：yanyu626＠126.com

1001-3601（2016）09-0394-0105-04