北虫草最佳组织分离期的筛选

贺晓龙，王殿振，查 磊，杨宇童

（1.延安大学生命科学学院/陕北微生物资源开发与利用研究中心，陕西延安716000；2.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西延安716000）

北虫草最佳组织分离期的筛选

贺晓龙1，2，王殿振1，查 磊1，杨宇童1

（1.延安大学生命科学学院/陕北微生物资源开发与利用研究中心，陕西延安716000；2.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西延安716000）

为提高北虫草母种质量，促进其商业化生产，采用组织分离法研究北虫草5个不同生长发育期（原基期，子实体生长15d、30d、45d和60d）组织分离对母种质量的影响。结果表明：原基期组织分离得到母种的菌丝体生长速度最快，为3.18mm/d，菌丝体生长整齐、纯白、浓密且转色效果最好，与其他4个时期得到母种的菌丝体生长速度间差异极显著。北虫草组织分离母种宜选用原基期组织。

北虫草；组织分离；菌丝体生长速度与长势；转色

北冬虫夏草〔Cordycepsmilitaris（L.）Link〕又称北虫草、蛹虫草，属子囊菌门（Ascomycota）盘菌亚门（Pezizomycotina）粪壳菌纲（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocreales）麦角菌科（Clavicip itaceae）虫草属（Cordyceps）。目前，世界上已发现虫草属真菌400多种，我国记录有100种［1］。北虫草是冬虫夏草的同属异种真菌，二者的化学成分和营养成分以及药用功效十分相似［2］。北冬虫夏草的虫草素、虫草酸和虫草多糖含量明显高于天然冬虫夏草，其含量分别为冬虫夏草的29倍、27倍和32倍，而氨基酸含量基本接近，是天然冬虫夏草的理想代用品［3］。20世纪90年代以来，有关北虫草药化、药理、毒理和毒性的研究以及安全评价证实人工栽培的北虫草无毒副作用。其不仅具有滋补强身、补肺益肾、镇静、平喘、抗心率失常、抗疲劳、抑制疡细胞、治疗肺结核、抗疲劳、抗肿瘤和抑制癌细胞等特殊功效，而且可以增强机体免疫功能［4］，其功效可与人参、鹿茸相媲美［5］。由于野生北虫草在自然界数量很少，资源奇缺，采集困难，因此，价格昂贵而享有“国宝”之誉。

北虫草人工栽培驯化已获得成功且可进行商业化生产，其生产所用菌种大多采用野生虫草分离得到［6］。李青苗等［7-8］研究表明，组织分离可作为获得北虫草优质菌种的有效方法之一。许庆国［9］研究发现，选取鲜嫩北虫草子实体顶端靠尖1～2cm处（不去皮）组织分离获得的菌种其性状表现优异，遗传性状稳定一致。杨玉红等［10］进行了有关北虫草不同部位组织分离和继代培养研究且筛选出性状优良的菌株。胡中娥等［11］研究发现，组织分离＋复壮技术可明显提高北冬虫夏草菌种菌丝的生长活力。目前，有关北虫草组织分离的研究已有文献报道，但有关北虫草生长发育不同时期组织分离母种的研究则未见报道。为此，笔者采用组织分离方法研究北虫草5个不同生长发育期组织分离对母种质量的影响，旨在为提高北虫草人工栽培母种的质量，促进其商业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 北虫草组织 北虫草原基与不同生长发育时期子实体，由延安大学食用菌实验室提供。

1.1.2 试剂 葡萄糖、琼脂、蛋白胨、K2HPO4和MgSO4均为分析纯，酵母片和马铃薯均为市购。

1.1.3 仪器 试验仪器包括高压蒸汽灭菌锅、隔水式电热恒温培养箱、电冰箱、电子天平、多功能微电脑电磁炉、超净工作台、超纯水机及玻璃仪器气流烘干器等。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理 1）培养基制备。用马铃薯200g＋琼脂20g＋葡萄糖20g＋蛋白胨5g＋酵母片5g＋K2HPO40.5g＋水1 000mL制备培养基，pH自然。用180mm×18mm的试管分装培养基，每支试管8mL，加盖棉塞，高压灭菌锅内121℃灭菌30min，完成后取出摆斜面，冷却，无菌检验后待用。2）北虫草组织的选取。分别选取原基期和子实体生长15d、30d、45d、60d等5个时期生长发育良好且未被污染的虫草组织。具体操作：原基期选取原基较多且分布均匀的栽培瓶；子实体时期按生长时间选取虫草形态良好，生长健壮的子实体。将选好的栽培瓶放入无菌操作室内待用。

1.2.2 组织分离培养 试验设5个处理，即，T1，原基期；T2，子实体生长15d；T3，子实体生长30d；T4，子实体生长45d；T5，子实体生长60d。参照文献［12］的方法，在超净工作台酒精灯火焰旁打开栽培瓶的封口膜。原基直接用接种锄挑取1小块接入到培养基中央，其他时期的分离材料用无菌剪刀剪取，用接种锄接入到培养基上。每个时期的虫草分别接9支，23℃恒温培养。每天定时观察，记录组织块在培养基上的定植萌发及菌丝生长情况。

1.2.3 转色 参照文献［13］的方法将培养完成的长满菌丝体的试管置于温度为20℃有散射光照射的环境中进行转色，每天定时进行观察，记录不同时期的转色速度，7d后观察不同时期的转色率。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2003进行数据统计，采用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同时期北虫草组织分离母种菌丝体的生长

从表可知：1）长势。T1的母种菌丝体生长速度较快，菌丝体长势好，整齐、纯白、浓密；T2、T3和T4其次，菌丝体长势较好，纯白、浓密但不整齐；T5的母种菌丝体生长速度较慢，长势较差，白，不整齐且较稀疏。方差分析结果F＝20.045（＞F4，10，0.01＝5.994），表明，处理间长势差异达极显著。2）日均生长速度。不同时期组织分离母种的菌丝体日均生长速度依次为T1（3.177mm/d）＞T2（2.737mm/d）＞T3（2.570mm/d）＞T4（2.373mm/d）＞T5（2.170mm/d）。多重比较表明，T1与其他4个处理母种菌丝体的生长速度差异极显著；T2、T3和T4与T5间差异极显著，T2和T3与T4间的差异显著。说明，北虫草原基期组织分离的母种菌丝体生长速度最快，长势最好，为母种组织分离的最佳时期。

2.2 不同时期北虫草组织分离母种菌丝体的转色效果

观察结果显示：转色7d后，菌丝体转色效果依次为T1（95%）＞T2（90%）＝T3（90%）＞T4（80%）＞T5（70%）。其中，T1的菌丝体转色效果最好，T2和T3次之，T5的菌丝转色效果最差。表明，原基期的菌丝体转色速度最快，是最适合的母种组织分离时期。

表 不同时期北虫草组织分离母种菌丝体的生长Table Mycelia growth of mother strains ofC.militarisobtained in various stages

3 结论与讨论

北虫草原基期组织分离得到的母种菌丝体生长速度最快（3.18mm/d），长势最好，转色最快且转色效果最好。因此，原基期是北虫草最佳的母种组织分离时期。原因可能与北虫草不同生长时期的菌丝体细胞活力有关。原基期的菌丝体细胞分化程度最低，细胞活力最高。在该时期进行组织分离得到的母种活力及长势最好。而生长成熟的子实体其菌丝体细胞分化程度高，细胞已经老化，细胞活力下降。所以该时期的子实体进行组织分离得到的母种活力较低，再生能力很弱，故生长速度慢，长势及转色效果差，不适合在这个时期进行组织分离母种。

［1］刘春泉，宋江峰，李大婧，等.北冬虫夏草多糖组分的分离纯化及结构研究进［J］.食品科学，2007（1）：370-372.

［2］王锐丽，段鸿斌，殷东林，等.代料栽培蛹虫草营养液的优化［J］.食用菌，2016（1）：35-36.

［3］秦秀丽，邢 力，尹 锐，等.北冬虫夏草人工培养固体培养基优化研究［J］.北方园艺，2013（6）：149-152.

［4］刘 芳，李 帅，高 剑，等.不同培养基配方对北虫草中蛋白质和氨基酸含量的影响［J］.黑龙江农业科学，2015（12）：15-17.

［5］叶 博.北虫草药理作用研究［J］.安徽农学通报，2009，15（9）：52-54.

［6］张宗豪.不同培养基对北虫草生长的影响［J］.青海畜牧兽医杂志，2009，39（4）：6-7.

［7］李青苗，郭俊霞，王晓宇，等.北虫草组织分离子实体生长情况的研究［J］.安徽农业科学，2015（15）：3-4.

［8］郭俊霞，李青苗，王晓宇，等.北虫草子实体组织分离菌丝生长比较研究［J］.时珍国医国药，2015（7）：1759-1760.

［9］许庆国.北虫草子实体组织分离技术试验［J］.食用菌，2013（1）：20.

［10］杨玉红，刘 芳，康宗利，等.北虫草菌种人工分离的研究［J］.中国食用菌，2012（1）：11-12.

［11］胡中娥，钟国祥，沈爱喜，等.北冬虫夏草组织分离及复壮菌种的试验研究［J］.江西农业学报，2013（10）：124-125，134.

［12］锁现民，蔡树威，张现法，等.浅谈蛹虫草栽培菌种制作及鉴定［J］.食用菌，2009（4）：41.

［13］杜双田，周锋利，陈德育，等.温度对蛹虫草生长的影响［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2007，35（5）：159-162.

（责任编辑：王 海）

Screening of Optimal Tissue Isolation Period ofCordycepsmilitaris

HE Xiaolong1，2，WANG Dianzhen1，ZHA Lei1，YANG Yutong1
（1.CollegeofLifeSciences/ResearchCenterofMicrobialResourcesDevelopmentandUtilizationinNorthern Shaanxi，Yan’anUniversity，Yan’an716000；2.RegionalBiologicalResourcesConservationandUtilizationin ShaanxiProvinceEngineeringResearchCenter，Yan’an，Shaanxi716000，China）

In order to improve the mother strain quality ofC.militaris，promote the commercial production，tissue isolation method was employed to explore the effects of organization separation in five different growth and development period（primordial stage and fruiting body growth 15d，30d，45dand 60d）on mother strain quality ofC.militaris.Results：Mycelia growth rate of mother strains obtained in primordial stage was the highest，3.18mm/d.The mycelia were of neat growth，pure white color，thick and best coloring effects，the growth speed of which was extremely significantly different with that obtained in the other four stages.The tissue separation ofC.militarisshould be conducted in primordial stage.

Cordycepsmilitaris；tissue isolation；growth rate and growth vigor of mycelium；coloring

S567.3＋5

A

2016-05-05；2016-08-13修回

陕西科技厅协同创新项目“陕北能源化工基地石油废弃物无害化生物修复处理关键技术研究”（2015XT-34）；陕西省教育厅科研项目“延安地区北虫草菌种分离与复壮研究”（15JK1815）；延安大学2015年省级大学生创新训练计划项目“榆黄蘑液体发酵条件优化”（1450），研究生教育创新项目“北虫草菌种分离与复壮方法的筛选研究”（2015）

贺晓龙（1982-），男，实验师，硕士，从事生物技术与食用菌研究。E-mail：Xiongyx＠vip.sina.com

1001-3601（2016）09-0389-0089-02