脑通汤对缺氧-复氧损伤脑微血管内皮细胞的保护作用*

何　筑， 况时祥， 张树森， 邹家莉

(1.贵阳市第三人民医院， 贵州 贵阳　550000； 2.贵阳中医学院第二附属医院， 贵州 贵阳　550003)



·基础研究·

脑通汤对缺氧-复氧损伤脑微血管内皮细胞的保护作用*

何筑1， 况时祥2**， 张树森2， 邹家莉2

(1.贵阳市第三人民医院， 贵州 贵阳550000； 2.贵阳中医学院第二附属医院， 贵州 贵阳550003)

[摘要]目的： 探讨脑通汤对缺氧-复氧损伤脑微血管内皮细胞(BMECs)的保护作用及机制。方法： 将大鼠原代BMECs培养传代至第二代，分为对照组、正常血清组、缺氧-复氧模型组、大、中、小剂量脑通汤含药血清组，后5组细胞均放入三气培养箱中持续通入95% N2和5% CO2混合气体缺氧24 h再复氧2 h制作脑缺血再灌注细胞模型；采用MTT法检测缺氧24 h和复氧2 h时 BMECs的活性并计算细胞存活率，实时荧光定量PCR法检测BMECs中HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA的表达。结果： 缺氧24 h时，模型组的BMECs的活性及存活率较对照组明显下降(P<0.05)，与正常血清组及各剂量含药血清组比较差异无统计学意义(P>0.05)；复氧2 h时各剂量含药血清组BMECs的活性及存活率均较模型组明显升高(P<0.05)，正常血清组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)；模型组HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA的表达量均升高(P<0.05)，与模型组比较，各剂量含药血清组的HIF-1α、VEGF mRNA的表达量明显升高，MMP-9 mRNA的表达量明显下降，脑通汤大、中剂量组变化更显著(P<0.01)；正常血清组与模型组比较上述3种mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论： 脑通汤可以保护缺氧-复氧损伤的BMECs，其机制可能与其能上调HIF-1α、VEGF mRNA表达以及下调MMP-9 mRNA表达有关。

[关键词]脑通汤； 缺血再灌注； 脑微血管内皮细胞； 血脑屏障； 通透性

缺血性脑血管病是导致血管性痴呆(vascular dementia,VD) 的主要病因[1]，缺血再灌注损伤参与并介导了缺血性脑血管病的重要病理生理过程[2]。研究认为血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)结构及功能的损伤不仅参与脑缺血再灌注损伤的病理生理[3]，也与VD的发生发展密切相关[4]。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是检测BBB的结构及功能损伤时常用到的指标。脑微血管内皮细胞(brain microvascular endoth-elial Cells,BMECs)是各种生理、病理因素作用的靶细胞。本课题组前期的研究证实脑通汤可以有效改善VD早期患者认知功能[5]。本实验利用离体培养大鼠脑BMECs制备体外细胞缺氧-复氧模型模拟体内脑缺血再灌注损伤,观察脑通汤对缺氧-复氧损伤BMECs中HIF-1α，VEGF,MMP-9 mRNA表达的影响，探讨脑通汤对缺氧-复氧损伤BMECs的保护作用及可能机制。

1材料

1.1实验动物

SD大鼠，雄性，SPF 级，体重：(200±20)g，购自于重庆腾鑫生物技术有限公司，许可证号SCXK(渝)2012-0005。 1周龄SD 大鼠，雄性，SPF 级，购自于贵阳学院实验动物中心，合格证号:SCXK(黔)2012-0001。

1.2主要药品与试剂

脑通汤(中药成分) 由贵阳中医学院第二附属医院中药房提供。高糖DMEM、0.25%胰酶、双抗均购于Hyclone公司， MTT、二甲基亚砜、鼠尾明胶、胶原酶II均购于Sigma公司，羊抗兔IgG-FITC、ICAM-1(CD54，批号PB0054)均购于博士德公司；Ⅷ因子相关抗原抗血清(北京博奥森)，胎牛血清(四季青)，无糖DMEM(Gibco)，Trizol(批号1596-026，invitrogen)，SYBR Green PCR 试剂盒(批号K0223，Thero)，逆转录试剂盒(批号K1622，Fermentas)。

1.3脑通汤含药血清的制备

脑通汤(黄芪40 g、西洋参8 g、天麻20 g、水蛭24 g、葛根60 g)每剂方药152 g，加水500 mL煎制，醇沉提取，高温消毒，制成含生药量为3.04 g/mL(大剂量脑通汤组)，1.52 g/mL(中剂量脑通汤组)，0.76 g/mL(小剂量脑通汤组)。SD大鼠60只,随机分为正常组和大、中、小剂量脑通汤组4组，每组15只。参照《药理实验方法学》[6]换算出灌胃给药量,大、中、小剂量脑通汤组给药量分别为15.2、7.6、3.8 g/(kg·d)，正常组灌服生理盐水10 mL/(kg·d)，一天2次，连灌4 d；股动脉采血, 3 000 r/min离心20 min,分离血清,过滤除菌，灭活，获得正常血清及脑通汤大、中、小剂量含药血清，-20 ℃冻存。

1.4BMECs的原代培养、传代及鉴定

参考文献[8-12] 方法，稍作改良。选择出生1周以内SD大鼠，参照大鼠脑立体定位图谱，剥离双侧大脑皮质，于预冷D-Hanks液中将其剪碎成1 mm3大小组织块，加入0.25%胰蛋白酶，消化15 min，滴加20% FBS培养基(含79% DMEM高糖培养基、20% FBS和1% 双抗)终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，过筛目(先过100目，再过200目)，最后收集200目以上的细胞，在沉淀组织中滴加适量0.1% Ⅱ型胶原酶消化20 min，滴加20% FBS培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入适量20% FBS培养基吹打混匀，制成细胞悬液，转移至2%明胶包被过的25 cm2培养瓶中。放入37 ℃，5% CO2培养箱内孵育，隔2～3 d 换液1次。7～9 d后细胞呈现典型的单层“铺路石”样排列，用0.125%胰蛋白酶消化传代，Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色鉴定阳性，证明为BMECs。

1.5BMECs分组

取第2代BMECs随机分为6组：正常组、缺氧-复氧模型组、正常血清组、大、中、小剂量脑通汤含药血清组，后5组细胞均行缺血再灌注，后4组分别给予10%正常血清及10%脑通汤大、中、小剂量含药血清。10%正常血清或10%脑通汤大、中、小剂量含药血清培养基分别用89%的无胎牛血清的DMEM培养基、1%双抗和10%正常血清或10%脑通汤不同剂量含药血清配制而成。

1.6BMECs缺氧/复氧模型的建立

参照文献[13]的造模方法稍加改良，制备细胞缺氧24 h再复氧2 h模型：用无糖DMEM洗涤2次，缺氧前缺氧-复氧模型组、正常血清组、大、中、小剂量脑通汤含药血清组加入10% FBS培养基、10% SD大鼠正常血清及10%脑通汤大、中、小剂量含药血清培养基，置入37 ℃三气培养箱,持续通入95% N2与5% CO2混合气体，流速保持在0.5 L/min，缺氧24 h。再复氧时5组分别换液，培养基与缺氧前相同，放回37 ℃、5% CO2培养箱持续复氧2 h。对照组用10% FBS培养基正常培养26 h，不做任何处理。

1.7MTT比色法测定BMECs的活性及存活率

取第二代的BMECs以5×105/mL的细胞密度接种于96孔板中，造模后，吸弃96孔板各孔液体，每孔加四甲基偶氮唑蓝磷酸缓冲液MTT(5 g/L)20 μL，混匀，37 ℃孵育4 h。弃上清液，每孔加100 μL的二甲基亚砜，均匀振荡10 min，用酶标仪(微量波长为570nm)处读取吸光度值(OD值)，用OD值表示BMECs活性。细胞存活率以对照组OD值均数为100%，计算细胞存活率(%)=各孔OD值/对照组OD值均数×100%。

1.8实时荧光定量PCR法检测BMECs的HIF-1α、VEGF、MMP-9mRNA的表达

HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA引物均由上海基尔顿生物科技有限公司设计。引物设计如下：HIF-1α mRNA上游引物5′ CAGCGATGACACGGAAAC 3′，下游引物5′ AGTGACTCTGGGCTTGAC 3′，扩增长度210 bp；VEGFmRNA上游引物5′GAGTCTGTGCTCTGGGATTTG 3′，下游引物5′TCCTGCTACCTCTTTCCTCTG 3′，扩增长度188 bp；MMP-9 mRNA上游引物5′ TCTCTACTGGGCATTAGGG 3′，下游引物5′ GTGTCCGAGGAAGATACTTG 3′，扩增长度236 bp；β-catin mRNA上游引物： 5′ GTCGGTGTGAACGGATTTG 3′，下游：5′ TCCCATTCTCAGCCTTGAC 3′，扩增长度181 bp。用Trizol提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，用cDNA按照SYBR Green PCR 试剂盒说明进行实时荧光定量RT-PCR反应。反应总体积25 μL，PCR 参数设置：预变性，95 ℃，10 min，变性 95 ℃，15 s，退火60 ℃，45 s，延伸60 ℃，1 min，总共40次循环。反应结束时仪器自动显示达到阈值时的循环圈数(threshold cycles,CT)值。以内参 β-actin mRNA的CT值标化HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA的 CT值，目的基因相对表达量用2-ΔΔCT方法计算[14]。公式如下：样品目的基因ΔCT=样品目的基因CT值-内参基因CT值；ΔΔCT =样品目的基因ΔCT值-对照组ΔCT值。

1.9观察指标

倒置显微镜下观察BMECs形态，第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光鉴定BMECs，比较各组BMECs的活性及存活率,观察BMECs中HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA的表达。

1.10统计学分析

2结果

2.1原代脑BMECs鉴定

A　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　B注： A为BMECs培养第5天，B为 BMECs培养第7天 图1　原代BMECs 形态学观察(×400)Fig.1　Morphological observation of primary BMECs

倒置显微镜下观察BMECs形态：12 h大部分细胞贴壁，24后细胞伸出细小突起。培养4 d，细胞围绕成“漩涡状”；细胞继续生长7～9 d后融合，呈现典型的“鹅卵石样”密集的排列；细胞形态呈现扁平梭形，椎体形，多角形，核卵圆形，可见核仁。第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光鉴定：荧光倒置显微镜下观察,传代细胞胞核周围的胞浆内均出现黄绿色荧光,即第Ⅷ因子抗原阳性,阳性率达95%,胞质与胞核间界限明显,证明细胞为BMECs。见图1、2。

图2　BMECs Ⅷ因子相关抗原免疫荧光鉴定(×400)Fig.2　Identification of factor VIII related antigen in BMECs by immunofluorescence

2.2BMECs的活性及存活率

缺氧24 h时模型组、脑通汤不同剂量含药血清组、正常血清组的BMECs活性及存活率均较对照组明显下降(P<0.05)，这5组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；复氧2 h时5组BMECs活性及存活率仍均较对照组明显下降(P<0.05)，而脑通汤不同剂量含药血清组较缺氧-复氧模型组明显升高(P<0.05)，正常血清组较模型组差异无统计学意义(P>0.05)。复氧2 h时模型组、脑通汤不同剂量含药血清组、正常血清组的BMECs的活性及存活率组内比较均较缺氧时明显升高(P<0.05)。见表1。

Tab.1　BMECs activity and the survival rate at 24 hours after hypoxia

分组BMECs缺氧24hBMECs活性(OD值)存活率(%)BMECs复氧2h活性(OD值)存活率(%)对照组0.748±0.0651000.748±0.065100缺氧-复氧模型组0.375±0.052(1)51.22±3.11(1)0.425±0.047(1)(3)62.38±4.45(1)(3)正常血清组0.388±0.052(1)52.38±4.02(1)0.438±0.051(3)63.27±4.57(3)脑通汤大剂量含药血清组0.412±0.044(1)51.34±5.28(1)0.685±0.052(2)(3)82.75±7.41(2)(3)脑通汤中剂量含药血清组0.405±0.039(1)53.22±5.42(1)0.638±0.048(2)(3)77.53±6.55(2)(3)脑通汤小剂量含药血清组0.448±0.046(1)52.59±4.93(1)0.576±0.044(2)(3)61.05±5.34(2)(3)

(1)与同一时间点对照组比较，P<0.05；(2)与同一时间点模型组比较，P<0.05，(3)与缺氧24 h比较，P<0.05

2.3BMECs中HIF-1α、VEGF、MMP-9mRNA表达

实时荧光定量PCR结果显示:与正常细胞比较，模型组HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA的相对表达量均升高(P<0.05)。与模型组比较，脑通汤大、中、小剂量含药血清组的HIF-1α、VEGFmRNA相对表达量明显升高，MMP-9 mRNA的相对表达量呈现明显下降趋势，这3种基因的表达变化在脑通汤大、中剂量含药血清组更为显著(P<0.05)；正常血清组与模型组比较，HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见图3和表2。

3讨论

BBB主要由脑毛细血管内皮细胞及其间的紧密连接、基底膜和细胞外基质、星形胶质细胞足板等组成，是维持中枢神经系统内环境稳定的重要天然屏障，也是血液循环重要物质转运到中枢的交通枢纽。BBB破坏是缺血再灌注损伤的重要环节，研究显示，在脑缺血再灌注损伤时，多种重要调控因子如HIF-1α、VEGF、MMP-9等参与并调控脑缺血再灌注BBB的结构及功能的损伤[15-17]。HIF-1是存在人与哺乳动物细胞低氧应答反应中的一种重要核转录调节因子。其生物活性主要由α亚基所决定，HIF-1α的表达严格受到细胞氧浓度的调节[18]。HIF-1α既是调节亚基又是活性亚基，在缺血再灌注损伤下可诱导HIF-1α快速大量的表达[19]。而在缺氧时，HIF-1α在胞浆内合成增加，可以对其下游基因，如MMPs、VEGF等基因进行调控[20]。有研究证实，HIF-1α的表达与BBB通透性的改变息息相关[21]。因而，促进HIF-1α表达是保护缺血再灌注损伤中BBB及其结构基础脑微血管内皮细胞的关键环节。

注:A、B、C、D分别为 HIF-1α、VEGF和MMP-9及内参 GAPDH mRNA 扩增动力学曲线图3　HIF-1α、VEGF和MMP-9及内参 GAPDH mRNA扩增动力学曲线Fig.3　Amplified kinetic curves of HIF-1α,VEGF, MMP-9 and GAPDH mRNA

分组HIF-1αmRNA(2-ΔΔCT)VEGFmRNA(2-ΔΔCT)MMP-9mRNA(2-ΔΔCT)对照组0.293±0.0320.310±0.0400.334±0.025缺氧/复氧组模型组0.485±0.052(1)1.008±0.128(1)3.010±0.260(1)正常血清组0.748±0.041(2)1.372±0.363(2)0.943±0.148(2)脑通汤大剂量含药血清组2.148±0.062(2)3.208±0.446(2)0.409±0.054(2)脑通汤中剂量含药血清组1.847±0.032(2)2.669±0.265(2)0.582±0.081(2)脑通汤小剂量含药血清组1.275±0.048(2)2.234±0.552(2)0.805±0.102(2)

(1)与对照组比较，P<0.05；(2)与模型组比较，P<0.05

VEGF又称血管通透性因子，在新生血管及损伤BBB通透性方面起着重要作用。生理状态下，VEGF在脑内仅有少量表达。在脑缺血再灌注损伤VEGF通过HIF-1α基因诱导表达发挥脑保护作用，陶陶，陈懿等[21-22]研究证实,在脑缺血再灌注中促进VEGF高表达，或通过中药复方干预提高HIF-1α的表达，进而激活HIF-1α/VEGF通路，更进一步促进VEGF的表达，能达到保护大鼠脑缺血再灌注损伤的作用。

MMP-9是基质金属蛋白酶家族(MMPs)的重要成员，生理状态下，MMP-9合成后以无活性的酶原的形式存在脑组织中，在脑缺血时MMP-9被激活，可降解细胞外基质成分，破坏BBB的完整性。研究显示，在大鼠脑缺血再灌注损伤后MMP-9参与脑水肿的形成,改变BBB的通透性,与BBB结构及功能的破坏密切相关[23-24]。祝美珍等[25]进一步研究证实，通过中药复方清热化瘀Ⅱ号干预，下调脑缺血再灌注损伤MMP-9蛋白的表达，可以发挥脑保护作用。

脑通汤是况时祥教授通过长期临床经验累积针对VD早期的病理特征：脾气亏虚，清阳不升，脑络瘀阻，脑髓失养，兼肝阳浮越，加重脑部气血瘀滞而研制出来的。方中黄芪补气健脾，升清行血；水蛭活血通络；辅以葛根，升清活血，天麻潜降浮阳，又可通络，二药共奏升清阳，降浮阳，调畅并运行气血精微上荣于脑的作用；佐以西洋参益气养阴，健脑益智。诸药合用，共奏补气升阳，化瘀通络，潜降浮阳之功。本课题前期临床及实验证实[5，26-28]，本方不仅可以改善VD早期患者认知功能，改善VD大鼠学习及记忆能力, 还可减少VD大鼠海马CA1区的神经细胞及椎体细胞凋亡。

本实验结果显示，采用缺氧-复氧模型复制脑缺血再灌注BMECs损伤后，发现模型组的BMECs活性及存活率降低，而HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA的表达量明显升高；给予中药复方脑通汤不同剂量含药血清干预后，BMECs活性及存活率较模型组明显升高，HIF-1α、VEGFmRNA的表达量显著上调，而MMP-9 mRNA的表达量呈现明显下调趋势。由此可见，在缺氧-复氧损伤后一方面HIF-1α基因高表达可以有效激活HIF-1α/VEGF通路，进而促进下游靶基因VEGF的表达；另一方面HIF-1α高表达可以诱导下游靶基因MMP-9的进一步增高。给予脑通汤不同剂量含药血清干预后，发现本方可以进一步有效的上调HIF-1α基因的表达，进而促进HIF-1α/VEGF通路的激活，继续上调下游靶基因VEGF的表达；同时可显著下调MMP-9基因表达，共同参与降低血脑屏障通透性。

概言之，脑通汤可以保护缺氧-复氧损伤的脑微血管内皮细胞，可能与两种途径共同参与并介导降低BBB通透性有关，(1)上调HIF-1α mRNA表达，进而促进HIF-1α/VEGF通路的激活，增加VEGFmRNA的表达；(2)促进HIF-1 αmRNA的高表达，进而抑制下游靶基因MMP-9 mRNA的表达。

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(2015-10-09收稿，2015-12-21修回)

中文编辑： 周凌； 英文编辑： 周凌

Study on Protective Effects of Naotong Soup on Brain Microvascular Endothelial Cell Injury Induced by Hypoxia-reoxygenation

HE Zhu1, KUANG Shixiang2, ZHANG Shuseng2, ZOU Jiali2

(1.ThirdPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550000,Guizhou,China； 2.TheSecondAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550003,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the protective effects of Naotong soup on brain microvascular endothelial cell(BMECs) injury induced by hypoxia-reoxygenation and its mechanism. Methods: Primary rat BMECs were identified and passaged to the second generation. BMECs were divided into control group, normal serum group, hypoxia-reoxygenation model group, large, medium and small dose of Naotong soup medicinal serum group, BMECs in the later 5 groups were put into the three gas incubator for continuous infusion of mixture gas (95% N2 and 5% CO2) for 24 h and reoxygenation for 2 h to establish the model of cerebral ischemia and reperfusion. The activity and the survival rate of BMECs at 24 hours after hypoxia and 2 hours after reoxygenation were evaluated by MTT assay. Real-time fluorescent quantitative PCR was adopted to detect the relative expression levels of HIF-1α,VEGF and MMP-9 mRNA. Results: Compared with normal cell groups，BMECs activity and the survival rate of model groups was significantly lower after hypoxia for 24 h(P<0.05)in the later five groups, and there was no significant difference among the later 5 groups (P>0.05). Compared with model group, different dose of Naotong soup medicinal serum groups were significantly increased after reoxygenation for 2 h(P<0.05). The relative expression levels of HIF-1α, VEGF and MMP-9 mRNA increased in model group (P<0.05). Compared with the model group, the relative mRNA expression levels of HIF-1α and VEGF increased and MMP-9 mRNA decreased in Naotong soup medicinal serum groups, the changes were more significant in large, medium Naotong soup medicinal serum groups(P<0.05). However，there was no significant difference between normal serum group and model group (P>0.05). Conclusions: Naotong soup can protect BMECs after hypoxia -reoxygenation injury. Its mechanism may relate to up-regulate HIF-1α and VEGF mRNA levels and down-regulate MMP-9 levels.

[Key words]Naotong soup; ischemia and reperfusion; brain microvascular endothelial cells; blood-brain barrier; permeability

[中图分类号]R743； R965

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)01-0017-07

*[基金项目]国家自然科学基金(81160490)

**通信作者 E-mail:kuangshixiang2009@163.com网络出版时间：2016-01-07

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160107.1810.004.html