二苯并噻吩脱硫菌Rhodopseudomonas sp.AS-21的脱硫条件优化

韩 康，谷朝阳，赵朝成

(中国石油大学(华东)化学工程学院，山东 青岛 266580)

二苯并噻吩脱硫菌Rhodopseudomonas sp.AS-21的脱硫条件优化

韩 康，谷朝阳，赵朝成

(中国石油大学(华东)化学工程学院，山东 青岛 266580)

以二苯并噻吩(DBT)为模式物筛选得到专一性脱硫菌Rhodopseudomonas sp.AS-21。通过单因素考察实验结果分析温度、pH、碳源、氮源和DBT初始浓度对脱硫率和细胞浓度的影响，得出菌株的最适宜生长和脱硫条件：培养温度为30 ℃，初始pH为7.5，碳源为10 g/L甘油，氮源为2 g/L的氯化铵，DBT初始浓度为100 mg/L。利用Design-Expert软件进行显著性分析，结果表明温度、pH、DBT浓度影响的显著性较高。采用Box-Behnken Design(BBD)响应曲面法设计三因素三水平共20组实验，得到脱硫率和细胞质量浓度的二次回归模型。在Design-Expert软件模拟的条件下，以响应值最大为目标进行优化求解，结果表明在温度为29.70 ℃、pH为7.43、DBT初始浓度为105.47 mg/L时可得到最大脱硫率(72.32%)及最大菌株生长量(2.311 g/L)。经实验验证，所求最优解正确。

生物脱硫 二苯并噻吩 脱硫条件 优化

自1976年以来，全球低硫原油探明储量占原油总储量的15%～27%，并且以每年1.1%的速率下降，但石油需求量却在增长，因此高硫原油的开采量逐年上升，硫污染带来的问题凸显[1-2]。加氢脱硫是石油加工中的主要脱硫方法，但是近年来工业发展所产生的污染物已经远远超出了环境容量，开发新的脱硫方式迫在眉睫[3]。生物脱硫作为新的脱硫方式备受青睐。生物脱硫是指在常温常压状态下，利用微生物体内产生的特殊酶分解石油中的硫化合物，将其转化为易分离的物质，最后通过物理方法进行分离[4-6]。国内外关于生物脱硫的研究虽然已步入正轨，但脱硫菌种仍然较少，生存环境变化对菌种自身脱硫效果的影响尚不明确。目前发现的主要脱硫菌有芽孢杆菌属、红球菌属、节杆菌属和棒杆菌属等，但数量仍然较少。这些菌株可在不打开苯环的情况下脱除二苯并噻吩(DBT)中的硫，最大限度地保留燃料的热值[7-12]。

本课题以DBT作为硫源，对实验室筛选得到的脱硫菌株Rhodopseudomonas sp. AS-21(简称AS-21)的脱硫条件进行优化，考察温度、pH、碳源、氮源及初始DBT浓度对脱硫过程的影响，以DBT脱硫率和细胞质量浓度作为考察指标。

1 实 验

1.1 原 料

硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、葡萄糖、牛肉膏、蔗糖、淀粉、正十六烷、乙酸钠、磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、六水合氯化镁、二水合氯化钙、四水合氯化锰、六水合三氯化铁，分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产；氢氧化钠，分析纯，天津市博迪化工有限公司生产；盐酸，分析纯，开封东大化工有限公司试剂厂生产；二苯并噻吩，分析纯，美国SIGMA公司生产。

1.2 仪 器

SPX-250型生化培养箱，上海跃进医疗器械厂生产；HZQ-QX/QG全温振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司生产；雷磁PHS-25型pH计，上海仪电科学仪器有限公司生产；BCM-1000型生物净化工作台。

1.3 实验过程

取1.00 g DBT溶于100 mL丙酮溶液配制成浓度为10 g/L DBT丙酮溶液，将配制好的DBT溶液放入冰箱冷藏。

将磷酸二氢钾2.44 g、十二水合磷酸氢二钠14.03 g、六水合氯化镁0.36 g、二水合氯化钙1 mg、六水合三氯化铁1 mg、四水合氯化锰4 mg、碳源10 g、氮源2 g溶于1 L去离子水，配制成液体培养基。碳源分别为甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉、正十六烷，氮源分别为牛肉膏、酵母膏、胰蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵。在碳源为甘油、氮源为氯化铵时，所配制的液体培养基被称为基础培养基。

将液体培养基在121 ℃高温下灭菌20 min，冷却后取100 mL装入250 mL锥形瓶中，加入一定量的硫源(DBT丙酮溶液)，用盐酸溶液或NaOH溶液调节初始pH，并以5%的接种量接种菌株，然后将锥形瓶放入全温振荡器中，在一定温度、180 r/min的条件下培养3天，得到细菌发酵液。

取细菌发酵液25 mL于分液漏斗中，用盐酸调节pH至2.0，采用等体积的正己烷萃取发酵液中剩余的DBT，静置20 min后收集萃取液。由于培养液中的部分无机盐和水悬浮在萃取液中，将萃取液在8 000 r/min的条件下离心分离10 min，收集正己烷萃取液，用气相色谱定量分析DBT浓度，并计算脱硫率。

取8 mL细菌发酵液，在8 000 r/min的条件下离心分离10 min，分离后得到的沉淀为菌体，将其烘干、称重。配制0.1 mol/L的NaOH溶液，将6.8 g磷酸二氢钾溶于291 mL NaOH溶液中，用蒸馏水定容至1 L，然后将烘干的菌体加入其中，得到菌悬液。采用分光光度计，通过测定菌悬液在620 nm处的吸光度来确定细胞浓度。菌悬液在620 nm处有特征吸收峰，在一定的吸光度范围内，吸光度跟菌株细胞质量浓度有良好的线性关系，可以通过吸光度和菌株细胞质量浓度的关系绘出标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 温度对脱硫菌生长和脱硫效果的影响

采用基础培养基，在100 mg/L DBT为唯一硫源、pH为7的条件下，考察温度对AS-21生长及脱硫效果的影响，结果见图1。由图1可以看出：温度对AS-21生长量和脱硫率的影响趋势大致相同；低温时菌株生长量较低，随着温度上升，菌株生长量逐渐增大，在30 ℃左右达到最大值，此时细胞质量浓度为2.41 g/L，当温度超过30 ℃时，随着温度上升，菌株生长量显著下降，这说明高温和低温都不利于菌株的生长；随温度升高，脱硫率呈先增加后降低的变化趋势，在30 ℃左右时，脱硫效果最好，脱硫率达到78.55%，35 ℃以后脱硫率明显下降。这是由于脱硫作用依赖细菌中酶的作用，低温时，菌株生长量处于较低水平，酶的含量低，其活性也较低，随着温度升高，酶的含量增加且活性逐渐恢复，在30 ℃时，菌株生长量最大且酶活性较高，此时脱硫率达到最大值；当温度继续升高时，菌株对高温耐受力较差，同时酶由于空间结构的破坏而活性降低，所以高温时脱硫率明显下降。在40 ℃时，菌株生长量较低，虽然菌株生长受到抑制，但仍在产生酶，且由于酶具有一定的积累量，此时菌株的脱硫率仍可达30%以上。AS-21的适宜培养温度和适宜脱硫温度均为30 ℃左右。

图1 温度对AS-21生长和脱硫效果的影响■—脱硫率；▲—细胞质量浓度。 图2、4、6同

2.2 pH对脱硫菌生长和脱硫效果的影响

采用基础培养基，在100 mg/L DBT为唯一硫源、温度为30 ℃的条件下，用盐酸溶液或NaOH溶液调整初始pH，考察pH对AS-21生长及脱硫效果的影响，结果见图2。由图2可知：pH对AS-21生长量和脱硫率的影响趋势大致相同，随pH增加，两者均呈先增加后降低的变化趋势；pH为4～6时，AS-21生长量和脱硫率均较低，在pH大于6.5后，AS-21生长速率急剧增大，当pH上升到7.5时，AS-21生长量和脱硫率都达到最大值，脱硫率为74.58%，细胞质量浓度达到2.36 g/L，当pH大于7.5时，脱硫率和AS-21生长量都渐渐下降。由图3还可知，碱性环境对AS-21生长量和脱硫率的影响弱于酸性环境，该菌株显然对碱性环境的耐受力更强，因此AS-21中的酶对碱性环境的适应性更强。因此，AS-21的适宜培养pH和适宜脱硫pH均在7.5左右。

图2 pH对AS-21生长和脱硫效果的影响

2.3 碳源对脱硫菌生长和脱硫效果的影响

在DBT初始浓度为100 mg/L、温度为30 ℃、pH为7.5、氮源为氯化铵的条件下，考察液体培养基中的碳源种类对AS-21生长及脱硫效果的影响，结果见图3。由图3可知，以甘油作为碳源时，AS-21的生长量和脱硫率都大于其它碳源条件下的相应值，此时脱硫率为69.59%，细胞质量浓度为2.21 g/L。因此，AS-21培养基的适宜碳源为甘油。

图3 不同碳源对AS-21生长和脱硫效果的影响■—脱硫率；■—细胞质量浓度。 图5同

在DBT初始浓度为100 mg/L、温度为30 ℃、pH为7.5的条件下，甘油浓度对AS-21生长及脱硫效果的影响，结果见图4。由图4可以看出:在甘油浓度为10 g/L时，AS-21的生长量和脱硫率均达到最大值，细胞质量浓度和脱硫率分别为2.11 g/L和71.35%;在甘油浓度较低时，碳源量不足，AS-21因缺少碳源而无法持续增殖，菌株生长量较低，酶含量较低，脱硫效果较差；随着甘油浓度的增加，菌株生长量增加，在甘油浓度为10 g/L时达到最大值，此时也达到最佳脱硫效果；但当甘油浓度继续增加到一定程度时，由于微生物的不断增殖，其代谢产物会对微生物产生不利影响，反过来会遏制微生物的生长，使微生物生长量开始下降，脱硫率也随之降低。因此，最佳甘油浓度为10 g/L。

图4 甘油浓度对AS-21生长和脱硫效果的影响

2.4 氮源对脱硫菌生长和脱硫效果的影响

图5 不同氮源对AS-21生长和脱硫效果的影响

在DBT初始浓度为100 mg/L、温度为30 ℃、pH为7.5、碳源为甘油的条件下，考察液体培养基中的氮源种类对AS-21生长及脱硫效果的影响，结果见图5。由图5可知：不同氮源对AS-21生长和脱硫效果的影响是不同的，其中酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨等有机氮源比硝酸铵、硫酸铵、氯化铵等无机氮源更有利于菌株的生长，采用有机氮源时AS-21的细胞质量浓度均在1.90 g/L以上，采用无机氮源时AS-21的细胞质量浓度均在1.50 g/L以下；然而，不同氮源对脱硫率的影响与对AS-21生长量的影响恰恰相反，无机氮源比有机氮源更有利于菌株的脱硫，其中氯化铵的效果最佳，脱硫率可达76.55%。这是由于不同氮源对AS-21菌株酶的合成作用效果不同，而酶对脱硫效果的影响十分显著，尽管有机氮源使菌株生长量较高，但不利于酶的合成，因此脱硫率和细胞质量浓度没有呈现正相关关系。对于这种情形，可能是由于有机氮源中含有能干扰微生物脱硫的含硫氨基酸(如蛋氨酸、半胱氨酸等)，抑制了菌株脱硫活性的发挥。

2.5 DBT初始浓度对脱硫菌生长和脱硫效果的影响

采用基础培养基，在温度为30 ℃、pH为7.5的条件下，考察DBT初始浓度对AS-21生长及脱硫效果的影响，结果见图6。由图6可知：随着DBT初始浓度的增加，AS-21生长量和脱硫率均呈先增加后降低的变化趋势，当DBT初始浓度为100 mg/L左右时，AS-21生长和脱硫效果均达到最佳状态，细胞质量浓度和脱硫率分别为2.56 g/L和76.58%。这是由于当DBT初始浓度较低时，DBT作为唯一硫源，其量较少，阻碍了AS-21的生长，菌株中酶的合成也受到影响；但是当DBT初始浓度过高时，过量的DBT对AS-21产生毒害作用，抑制了脱硫菌株的生长，导致菌株生长量下降，同时酶的量也随之减少。因此，适宜的DBT初始浓度为100 mg/L。

图6 DBT初始浓度对AS-21生长和脱硫效果的影响

2.6 培养条件的优化

2.6.1 显著性因子筛选实验(PB) 在单因素实验结果的基础上，依据实验过程中每个因素的取值范围，对每个因素取高水平和低水平进行试验，高水平对应实验条件的最大值，低水平对应实验条件的最小值，如表1所示。

表1 PB实验因素与水平

通过利用Design-Expert软件对表1中5个因素进行显著性分析，结果如表2所示。由表2可知，贡献值较大的影响因素有3个，分别为温度、pH、DBT初始浓度。

表2 影响因子的显著性分析结果

2.6.2 BBD实验设计及结果 以温度、pH、DBT初始浓度为考察因素，即自变量，以菌株生长量和脱硫率为响应值，即因变量，采用Box-Behnken Design(BBD)响应曲面法设计三因素三水平共20组实验，各因子水平如表3所示，实验方案及结果如表4所示。

表3 BBD响应曲面法的因子水平

表4 BBD响应曲面法的实验方案及结果

利用Design-Expert软件对表4中实验数据进行多元回归拟合，获得二次多项式回归方程预测模型，如式(1)和式(2)所示。

(1)

(2)

式中：Y1为脱硫率，%；Y2为细胞质量浓度，mg/L；X1为温度，℃；X2为pH；X3为DBT初始浓度，mg/L。

在Design-Expert软件模拟的条件下，以响应值最大为目标进行优化求解，结果表明，在温度为29.70 ℃、pH为7.43、DBT初始浓度为105.47 mg/L时可得到最大脱硫率(72.32%)及最大细胞质量浓度(2.311 g/L)。采用上述最优脱硫条件和生长条件进行实验，在温度为29.70 ℃、pH为7.43、DBT初始浓度为105 mg/L、碳源为10 g/L甘油、氮源为2 g/L氯化铵的条件下培养3天后，测得脱硫率为74.00%、细胞质量浓度为2.49 g/L，与预测结果接近，说明该回归模型有效。

3 结 论

(1) 通过单因素考察实验得出AS-21菌株的最适宜生长和脱硫条件：培养温度为30 ℃，初始pH为7.5，碳源为10 g/L甘油，氮源为2 g/L的氯化铵，DBT初始浓度为100 mg/L。

(2) 利用Design-Expert软件进行影响因素显著性分析，结果表明温度、pH、DBT初始浓度影响的显著性较高。

(3) 采用BBD响应曲面法设计了三因素三水平共20组实验，得到脱硫率和细胞质量浓度的二次回归模型。在Design-Expert软件模拟的条件下，以响应值最大为目标进行优化求解，得到最优条件为温度29.70 ℃、pH为7.43、DBT初始浓度105.47 mg/L，在该条件下脱硫率为72.32%、细胞质量浓度为2.311 g/L；对上述最优条件进行实验验证，脱硫率为74.00%、细胞质量浓度为2.49 g/L，与模型预测结果十分接近。

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OPTIMIZATION OF DIBENZOTHIOPHENE DESULFURIZATION CONDITIONS OF BACTERIUM RHODOPSEUDOMONAS SP. AS-21

Han Kang，Gu Zhaoyang，Zhao Chaocheng

(CollegeofChemicalEngineeringofChinaUniversityofPetroleum，Qingdao，Shandong266580)

The specific DBT desulfurization bacterium Rhodopseudomonas sp. AS-21 was selected. The effects of temperature，pH，carbon source，nitrogen source，and initial concentration of DBT on S removal rate and cell concentration were investigated by single-factor experiments. The best conditions for the growth and desulfurization of AS-21 is 30 ℃，initial pH 7.5，concentration of glycerin as carbon source 10 g/L，concentration of NH4Cl as nitrogen source 2 g/L and initial concentration of DBT 100 mg/L. The significance analysis results with Design-Expert show that temperature，pH and initial concentration of DBT have higher effects on desulfurization. Box-Behnken Design (BBD) response surface methodology was used to design total 20 experiments with three factors and three levels to obtain quadratic regression model for desulfurization rate and cell mass concentration. The optimization solution of the maximum response values under the simulated conditions by Design-Expert software predicts that the best factors for the highest desulfurization rate and strain growth are 29.70 ℃，pH 7.43，initial concentration of DBT 105.47 mg/L. The highest desulfurization rate and strain growth are 72.32% and 2.311 g/L，respectively，which are proven to be right through experiments.

biodesulfurization；dibenzothiophene；desulphurization condition；optimization

2015-12-14；修改稿收到日期：2016-03-29。

韩康，硕士研究生，主要研究方向为原油生物脱硫和废水同步脱硫脱氮。

赵朝成，E-mail：zhaochch@upc.edu.cn。