陇东地区膜荚黄芪自毒作用研究*

张　博,石国玺,马世荣,刘瑞瑞,郭小强,杜晓刚(.甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室，陇东学院生命科学与技术学院,甘肃庆阳745000；.华池县林业总场城壕林场，甘肃华池74563)



陇东地区膜荚黄芪自毒作用研究*

张博1,石国玺1,马世荣1,刘瑞瑞1,郭小强1,杜晓刚2
(1.甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室，陇东学院生命科学与技术学院,甘肃庆阳745000；2.华池县林业总场城壕林场，甘肃华池745613)

摘要：模拟自然条件，以水做溶剂，采用超声波提取技术对膜荚黄芪根中的自毒物质进行提取，选择不同极性的溶剂进行萃取分离并进行生物检测。结果显示，膜荚黄芪根系水提物中有自毒物质；乙酸乙酯萃取组分的作用最强；经酸碱萃取分离的酸性组分和中性组分1对膜荚黄芪根的生长有显著抑制作用，0.0040和0.0020g DW(干重)· mL-1的酸性组分的抑制作用达到了极显著水平(P<0.01)；浓度为0.0040gDW·mL-1中性组分1，其抑制作用达到了显著性差异(P<0.05)；经0.0020g·mL-1的酸性组分水溶液处理膜荚黄芪幼苗，其受体细胞中可溶性糖和MDA的含量显著升高。该结果表明膜荚黄芪的自毒作用是造成黄芪连作障碍的原因之一。

关键词：膜荚黄芪;自毒作用;自毒物质;酸碱萃取分离

膜荚黄芪(Astragalus membranaceus)为蝶形花科植物，其干燥根为著名的滋补中药材[1]，具有增强机体免疫力、保肝、托毒生肌、抗衰老、降压等作用，主治气虚衰弱、久溃不敛、高血压、糖尿病、水肿等症，被称为“补气固表之良药”[2]，是我国出口的大宗商品药材之一。随着市场需求量持续增加，对野生黄芪的过度采挖，导致其野生资源濒临灭绝。因此，自上世纪70年代后期，商品黄芪主要来源于人工栽培[2]。但连作障碍已成为制约黄芪生产的瓶颈因素之一。连作障碍的发生不仅与土壤微生物种类与数量、理化性质劣变有关，还与药用植物根系分泌物和残株腐解物等引起的自毒作用有关[3]。

自毒作用是植物化感作用的一种特殊作用形式，是引起作物或中草药连作障碍的主要原因之一[4]。当前，对植物自毒作用的检测和自毒效应程度的量化，是研究自毒作用的基础[3,4]，而选择适当的方法提取与分离自毒物质，并对其活性进行测定，是研究化感作用的难点与重点。大量的研究已经证实，连作小麦(T.aestivum)、大豆(G.max)、豌豆(P.sativum)[5]、黄瓜(C.sativus)[5,6]、番茄(L.nesculentum)、西瓜(C.lanatus）等作物和黄连(C.chinensis Franch.)[7]、地黄(R. glutinosa)[8]、人参(P.ginseng)[9]、三七(R.notoginseng)[10]、丹参(S.miltiorrhiza)[11]、贝母(C.corymbosa)[12]、桔梗(P. grandiflorus)、蒙古黄芪(A.membranaceusvar. mongholicus)[13]等药用植物都存在严重的自毒作用，抑制其生长，影响产质量。鉴于此，本研究以陇东地区种植的膜荚黄芪为研究对象，模拟自然条件下化感物质进入土壤和环境的主要途径，对其根中的自毒物质进行提取和初步分离，并对其生物活性进行了检测，测定自毒条件下黄芪幼苗的部分生理生化指标，旨在研究膜荚黄芪自毒物质的特性和作用机理，为解决陇东干旱地区膜荚黄芪生产实践问题提供一定的科学依据。

1　材料和方法

1.1试验材料

膜荚黄芪于2013年10月中旬采自甘肃省宁县早胜镇，其种子购买于甘肃省农科所。

1.2主要试剂和仪器

试验所用的有机溶剂n-BuOH(正丁醇)、EtOAc(乙酸乙酯)、EtOH(乙醇)、MeOH(甲醇)、Pet.ether(石油醚)和CHCL3(氯仿)等均为AR级；S-120学生实验粉碎机(江苏)，SPX-250B微电脑光照培养箱，SHZ-DⅢ循环水真空泵(日本)，1001-VN旋转蒸发仪(郑州)，恒温加热板，HF-2.0超声循环提取仪(上海)。

1.3试验方法

1.3.1自毒物质的提取与分离

将刚采收新鲜膜荚黄芪的根除杂、洗净、晾干，用粉碎机粉碎(Φ=1mm)。称取粉末1000g，加入蒸馏水(粉末：蒸馏水=1:10)，超声循环提取仪提取2次，提取条件：20Hz、5～10W/cm2、保护T=35℃、间歇时间：2s、搅拌：920～950转/分，提取时间：30min。合并提取液，用多层纱布过滤，抽滤2次，减压浓缩，用正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚萃取三次，分别得到石油醚萃取组分、氯仿萃取组分、乙酸乙酯萃取组分和正丁醇萃取组分。将每个萃取组分，置于50℃的恒温干燥板上蒸干水分，制成浸膏并称重。分别精确称取少量萃取物浸膏蒸馏水溶解，微膜(= 20μm)过滤，配置成0.20、0.10和0.05gDW·mL-1浓度的处理液，保存备用。

1.3.2不同萃取组分对膜荚黄芪幼苗生长的影响

将经过消毒、预萌发处理的膜荚黄芪种子(大小、生物量一致）移入高温灭菌的纸床培养皿中，20 粒/皿，分别加入处理液5mL，每个浓度3个重复，以蒸馏水作对照，置于白天25℃、晚上20℃，光照2000lux、10h·d-1的微电脑光照培养箱中培养。每天补充适量的蒸馏水，以保持湿润，并记录萌发率，第7～10d，随机选10株，测量幼苗的根长和苗高。

1.3.3对自毒作用最强组分中自毒物质的进一步分离

经生物监测，自毒作用最强的组分为乙酸乙酯萃取组分。参考谭仁祥[14]的酸碱萃取分离法对乙酸乙酯组分进一步分离：精确称取一定量的乙酸乙酯萃取物浸膏，蒸馏水溶解，用10%Na2CO3调节至pH=8-9，用EtOAc萃取合并、蒸馏，将溶液分成E-tOAc相和水相两部分；再将EtOAc萃取物用蒸馏水溶解，用10%HCL调节至pH=1-2，然后用EtOAc萃取，将萃取后的溶液再用10%HCL调节至pH= 7.0，并用EtOAc萃取得到中性组分1；水相用10% Na2CO3调节pH=11-13并用EtOAc萃取得到碱性组分。将首次萃取得到的水相先用10%HCL调节pH=1-2，EtOAc萃取得到酸性组分，将本次萃取后剩余水相再用10%HCL调节pH=7.0，并用EtOAc萃取得到中性组分2。具体操作流程如图1所示。1.3.4酸碱萃取分离的四个组分对自身幼苗生长的比较

酸碱萃取分离得到的酸性组分、中性组分1、中性组分2和碱性组分，分别配置成浓度为4.0和2.0mg·mL-1(相当于蒸馏水超声提取浓度)的处理液，进行幼苗生长抑制试验，方法同1.3.2。

图1　酸碱萃取分离与生物检测的试验流程

1.3.5酸性组分处理后膜荚黄芪幼苗生理指标测定

膜荚黄芪幼苗的生理指标测定方法[15]：叶绿素含量采用分光光度法；丙二醛(MDA)含量采用TBA比色法；根系活力采用TTC法；过氧化物酶(POD)含量采用愈创木酚法；质膜透性采用电导仪法。

1.4数据处理方法

参照Williamson等[16]的方法，采用化感作用效应指数(RI)度量化感作用的强度，处理组和对照组间的差异显著性采用SPSS11.5软件对其在95%的置性水平进行LSD法检验。

式中：C为对照值；T为处理值；RI＞0为促进；RI＜0为抑制，绝对值的大小与作用强度一致。

2　结果与分析

2.1不同萃取组分对膜荚黄芪根长的影响

膜荚黄芪根粉末超声波提取物经过不同极性的有机溶剂分别萃取之后得到5个组分，将其分别制成干膏，并配置浓度分别为0.05、0.10和0.20gDW·mL-1的处理液进行生物活性检测，结果显示，不同萃取组分的不同浓度处理液对幼苗根的伸长生长都有不同程度的抑制作用：其中剩余水组分、氯仿组分和石油醚组分中的自毒作用效应最弱；乙酸乙酯组分的自毒效应最强，当浓度为0.10 和0.20gDW·mL-1时，其自毒效应显著高于对照，浓度为0.05gDW·mL-1时无显著自毒作用；正丁醇馏分浓度为0.05gDW·mL-1的处理液对黄芪苗高的生长成不显著的促进作用(如图2所示）。

2.2不同萃取组分对膜荚黄芪苗高的影响

从图3可以看出，以上5个萃取组分的不同浓度处理液对膜荚黄芪幼苗的苗高生长没有抑制作用，表现为促进作用，但其作用效果均未达到显著性差异。

图2　不同的萃取组分对膜荚黄芪根长的影响（LSD检验）

图3　不同萃取馏分对膜荚黄芪苗高的影响

2.3酸碱萃取分离得到的四种组分的生物活性检测

从表1可以看出，酸性组分中自毒物质对膜荚黄芪幼苗根的生长抑制作用最强，浓度为4.0和2.0mg·mL-1的处理液的作用都达到了极显著水平(P<0.01)；中性组分1中的自毒物质当浓度为4.0 mg·mL-1时，其抑制作用达到了显著性差异(P< 0.05)，低浓度虽然有一定的抑制作用，但没有达到显著性差异；碱性组分对幼苗根长生长有抑制作用，而对苗高的生长表现为促进作用；酸性组分2都对膜荚黄芪根的伸长生长无抑制作用。

表1　酸碱萃取得到的四种组分1的生物活性检测（LSD检验）

2.4乙酸乙酯组分中的酸性组分1对黄芪生理指标的影响（见表2）

表2　乙酸乙酯组分中的酸性组分对黄芪生理指标的影响

浓度为4.0mg·mL-1的酸性组分水溶液处理膜荚黄芪的幼苗，培养7-10d后，分别对其根系活力、MDA、TTC、POD、可溶性糖和相对电导率进行了测定。结果显示，在测试的6项生理指标中，可溶性糖和MDA的含量都有明显的升高，其作用效果使可溶性糖和MDA的含量分别增加了38.18%和14.31%，且都已经达到显著性差异(P<0.05)；叶绿素含量和相对电导率与对照相比有所升高，而TTC和POD含量相对降低了，但是其变化程度都没有达到显著性差异。

3　讨论

本文模拟自然环境，用超声波提取法对膜荚黄芪根中的自毒物质进行了提取，并浓缩、萃取、生测，得出的结论，赵杨景等[17]研究西洋参(Panax quinquefoliumL.)、紫苏(Perilla frutescens(L.)Britton.)籽和薏苡(Coix Lacrymajobi L.)根水提物的化感作用的结论是一致的，与王明道等[8]通过分离研究地黄中的化感物质，得出的乙酸乙酯组分中化感活性最强的结论也是一致的。表明膜荚黄芪根中的自毒物质易溶于乙酸乙酯中；其自毒效应主要表现为抑制自身根的伸长生长，也是造成膜荚黄芪连作障碍的原因之一。

酸碱萃取法是物质分离的常用方法之一[14]。膜荚黄芪根中的自毒物质经过酸碱萃取分离得的酸性组分的自毒效应最强，浓度为4.0和2.0mg·mL-1都达到了极显著水平(p<0.01)，且作用程度与浓度呈正相关，这进一步说明了其自毒物质主要是碱性物质和中性物质。植物长期生活在逆境胁迫中，会导致细胞内可溶性糖和MDA含量的显著升高，根系活力和POD含量都有不同程度的降低，这是由于逆境下植物能够感应外界胁迫，并通过自身调节系统，使之在生理和形态上发生的适应性反应，增强生存机会的原因。当膜荚黄芪的自毒物质浓度达到一定程度时，导致细胞内的酶系统发生改变，细胞内可溶性糖和MDA含量的显著升高，根系活力和POD含量都有不同程度的降低，影响了新陈代谢，降低产量和抗病性。在试验过程中观察到了自毒条件下的黄芪幼苗的根起初开始褐化，最后部分根开始腐烂。

本研究表明，膜荚黄芪根中的自毒物质种类较多，含量不同，自毒作用主要表现在能引起细胞内多种酶的含量变化，进而影响根的生长。至于引起膜荚黄芪自毒作用的是哪类物质，其结构和作用特点还有待于进一步研究。

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*基金项目：国家自然科学青年基金(31500427)；国家自然科学青年基金(31560139)。

中图分类号：Q-948