聚多巴胺球支撑银纳米粒子制备无酶过氧化氢生物传感器

徐署东 李卫东

(安徽省疾病预防控制中心 地方病与寄生虫病防治科，合肥 230601)

聚多巴胺球支撑银纳米粒子制备无酶过氧化氢生物传感器

徐署东 李卫东

(安徽省疾病预防控制中心 地方病与寄生虫病防治科，合肥 230601)

近年来，以聚多巴胺球支撑的纳米复合材料越来越受到人们的关注。聚多巴胺球有表面功能化基团如—OH、—NH2等，决定了聚多巴胺球可以充当多种纳米复合材料的活性载体。利用聚多巴胺良好的还原性制备并负载银纳米粒子于聚多巴胺球表面，制备出的新型复合材料银纳米粒子-聚多巴胺球(以下简写为Ag@pdop)。Au修饰电极和银纳米粒子对过氧化氢的还原反应均具有很好的催化性能，利用两者特点将其复合制备修饰电极实现对H2O2的无酶传感，检测灵敏度达到了14.7 μA/(mmol·L-1),检出限可达11.8 μmol/L，线性范围0.2～6.0 mmol/L，检测结果及抗干扰能力均令人满意。

聚多巴胺球；银纳米粒子；无酶传感器；过氧化氢

前言

多巴胺是一种重要的神经传导物质，存在于各种动物体内，在植物体内以多酚的前驱体形式存在。通过对生物表面胶黏性蛋白如贻贝类生物表面的结构研究，多巴胺是很好的包覆材料。自聚后的聚多巴胺几乎能在任何物质表面附着，具有良好的生物相容性，同时具有产生条件简单、成膜快等特性。在具氧气和弱碱性的溶液中，多巴胺及其它的儿茶酚胺都可自发进行聚合反应，该反应现象为多巴胺溶液由无色被氧化成粉红色，最终渐变为黑色的聚合物。

多巴胺表面有功能化的基团如—OH、—NH2等，可以吸附多种金属粒子以及金属化合物。利用柠檬酸钠的还原性可以将银离子还原为银纳米粒子负载到聚多巴胺球上。成功地应用于分析检测过氧化氢(H2O2)。

生物机体内众多氧化酶反应终产物或副产物是H2O2，因此实现其定量检测，在生物、环境以及食品分析方面具有重要意义[1]。对于痕量H2O2的分析测定[2-6]，电化学法具有简单、快速和高效等优点。而传统的分析方法，如化学发光法[7]、分光光度法[8]以及光谱法[9]，因其样品前处理费时费力、易引入外来干扰物等原因，对实际生物样品的检测应用受到很大的限制。电化学方法[10-12]具有快速、高效，前处理简单易于操作等特点。在电化学检测H2O2方法中，固定活性酶的电化学传感器得到广泛的应用，由于酶传感器容易发生酶的分解脱落、失活和储存条件要求高受环境影响大等现象，极大地限制了其分析应用。而无酶传感器，能有效地避免了酶基传感器的诸多缺点，但多数无酶传感器在测定H2O2时应用电压比较高，样品中共存易氧化的物质可能会干扰分析测定。因此实现在较低电位下测定H2O2就显得很重要。

纳米材料由于其大的比表面积能有效增加传感器的活性位点，使H2O2的氧化电位降低，电子传递得以促进，提高了分析的响应信号电流。银纳米粒子具有对H2O2还原良好的催化活性[13-14]。表现在还原H2O2时银纳米粒子修饰电极对其响应的催化电流显著增强。Welch等人也得出将银纳米粒子修饰在玻碳电极表面有利于H2O2的催化还原[15]。本方法成功合成复合材料银纳米粒子-聚多巴胺球(Ag@pdop)，并被引入到H2O2的无酶传感器的制备中，实现了对H2O2的分析测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

场发射扫描电镜(Hitachi-S4800S，FE-SEM，日本日立公司)，酸度计(pHS-3CT，上海大普仪器公司)，电子天平(FA2004，上海越平科学仪器公司)，PZ-1A真空干燥箱，磁力搅拌器(85-1，上海志威电器有限公司)，电化学工作站(CHI660C，中国上海辰华仪器公司)。

多巴胺(New Jersy公司)，Tris(上海生物化学试剂公司)，硝酸银(上海化学试剂有限公司)，异丙醇(北京百灵威科技有限公司)。柠檬酸三钠(中国医药集团上海化学试剂公司)。H2O2(30%，北京化学试剂公司)，使用中现配现用稀过氧化氢溶液。

磷酸缓冲储备溶液(PBS，0.1 mol/L)先用Na2HPO4和KH2PO4固体配制，其不同pH值系列溶液用NaOH(0.1 mol/L)和H3PO4调节得到。实验前所有的操作液通氮气除氧气20 min并保持氮气气氛。

1.2 聚多巴胺球的合成

聚多巴胺球(pdop)是在水醇混合溶剂中合成的。称取三(羟甲基)胺基甲烷0.062 1 g,并加入20 mL异丙醇,50 mL蒸馏水。称取多巴胺0.075 g,加入上述的混合溶液中，混合溶液磁力搅拌3 d。反应完成后，产物的溶液离心并且用去离子水洗3次，真空干燥24 h，温度设置为60 ℃。

1.3 聚多巴胺球上负载银纳米粒子复合材料的制备

将600 mg柠檬酸三钠加入聚多巴胺球的悬浮液中。在磁力搅拌的条件下，分次加入AgNO3(20 mL，88 mg)溶液于聚多巴胺的悬浮液中，搅拌6 h。反应完成后，产物溶液离心水洗3次。真空干燥24 h,温度设置为60 ℃。

1.4 制备修饰电极

预处理裸金电极，处理方法是依次在附有粒径为0.3、0.1和0.05 μm的三氧化二铝粉末的麂皮上对电极表面进行抛光，然后分别在盛有丙酮和纯水的超声浴中清洗。将一定量的pdop和Ag@pdop溶液均匀滴涂在预处理并晾干后的金电极表面，室温条件下自然晾干。

1.5 实验方法

应用三电极体系开展电化学实验，参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝电极，工作电极为裸金电极和相应的修饰。以磷酸盐缓冲底液(PBS，0.1 mol/L，pH=7.0)研究传感器的电化学性能，且均在室温下进行。

2 结果与讨论

2.1 合成材料的电镜表征

对合成的pdop和复合材料Ag@pdop进行了SEM表征。如图1所示，图1(A)表明聚多巴胺球已经合成，微球直径约500 nm，且球的大小均一。图1(B)为聚多巴胺球上负载银纳米粒子，可以看出银纳米粒子已经很好地负载到聚多巴胺球表面。表明柠檬酸钠可以成功地将Ag离子还原成Ag纳米粒子。

图1 pdop(A)和Ag@pdop(B)的SEM图Figure 1 SEM images of pdop (A) and Ag@pdop (B).

2.2 材料的XRD表征

图2是聚多巴胺球和Ag@pdop的XRD表征图。可以看到聚多巴胺球没有明显的XRD衍射峰。而Ag@pdop粉末制样的四个XRD衍射峰(2θ角为：38.1°、44.3°、64.5°和77.4°)分别对应于银纳米粒子的111、200、220和311四个晶面，这表明银纳米粒子被成功还原出来了。

图2 Pdop(a)和Ag@pdop(b)的XRD图Figure 2 XRD plots of pdop (a) and Ag@pdop (b).

2.3 修饰电极的电化学表征

用循环伏安法对三种材料制备的修饰电极进行电化学表征，如图3所示，在浓度为0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，裸金电极与负载聚多巴胺的修饰电极均没有出现明显的氧化还原峰，这表明作为基体材料裸金电极和聚多巴胺本身是没有电化学活性的。而Ag@pdop的修饰电极，可以看到有一对明显的氧化还原峰出现，峰电位分别位于0和0.2 V处，这是银纳米粒子的氧化还原特征峰。表明Ag纳米粒子已经成功地负载到聚多巴胺球上。当加入定量的H2O2于PBS底液中时，随着H2O2的加入，相应还原电流增加，-0.6 V处出现有明显的峰电流，该实验表明复合材料Ag@pdop在H2O2的还原过程中具有很好的催化能力。

图3 PBS(0.1 mmol/L，pH=7.0)中四种不同的修饰电极的循环伏安图Figure 3 Cyclic voltammograms of the four modified electrodes.

2.4 修饰电极对H2O2的电化学响应

如图4，随着加入不同浓度的H2O2，Ag@pdop的修饰电极对H2O2的催化电流也逐渐增加。说明H2O2对Ag纳米粒子有很好的响应。

图4 Ag@pdop的修饰Au电极在PBS(pH=7)中，加入不同浓度的H2O2(0、1、2、3、4、5、6 mmol/L)的循环伏安图Figure 4 Cyclic voltammograms of the Ag@pdop modified Au electrode in the 0.1mmol/L PBS (pH=7.0).

为研究修饰电极表面发生电化学反应的机理，开展了在磷酸盐(0.1 mol/L，pH=7.0)缓冲中Ag@pdop的修饰电极对H2O2的催化电流与扫速关系的电化学实验。图5(Ag@pdop Au电极在PBS(pH=7)和H2O2(5 mmol/L)中，插图为扫描速率与峰电流的线性关系)是考察同种电极在20～200 mV/s范围(从里到外依次为：20、40、60、80、100、120、140、160、180和200 mV/s)变换扫速得到的循环伏安曲线，结果表明随着扫描速度的增加，相应的电流也增大了，其中插入小图给出了氧化峰电流与扫描速率之间存在的一次线性关系，其回归方程为：ipa(μA)=18.4+0.008 19v，相关系数r=0.986 1，表明电极过程是受表面吸附控制的。

图5 Ag@pdop Au电极不同扫描速率的循环伏安曲线Figure 5 Cyclic voltammograms of Ag@pdop Au electrode in 0.1 mol/L pH 7.0 PBS with 5 mmol/L H2O2 at different scan rates.

用计时电流方法探究了H2O2在Ag@pdop修饰电极表面产生的响应电流与H2O2浓度的关系。连续地向5 mL PBS底液(pH=7.0，0.1 mol/L)中加入H2O2，记录安培电流值，如图6所示(应用电压-0.4 V。插入小图为Ag@pdop Au电极对浓度范围为0.2～6.0 mmol/L的H2O2线性关系图)。实验表明每加入一定量的H2O2，都会使还原电流相应增加。计算得出该修饰电极对H2O2检测灵敏度为14.7 μA/(mmol·L-1)，相关系数0.998，响应时间小于5 s，3倍信噪比时，检出限可达11.8 μmol/L，线性范围0.2～6.0 mmol/L。数据处理显示，催化电流大小与H2O2浓度有较好的线性关系。

图6 Ag@pdop Au电极对不同浓度H2O2响应的计时电流谱图Figure 6 Spectrograms of Ag@pdop Au electrode at different concentrations of H2O2.

2.5 抗干扰实验

图7 Ag@pdop Au电极对存在1.0 mmol/L AA,UA干扰实验条件下对H2O2检测响应的计时电流谱图Figure 7 A spectrogram of the Ag-Pdop Au electrode VS H2O2 in 1.0 mmol/L AA, UA) medium.

检测实际样品过程中，共存一些常见的电活性物质诸如抗坏血酸(AsA)，尿酸(UA)等会对传感信号产生干扰。如图7所示，以0.1 mol/L pH7.0的PBS为底液，底液中加入1 mmol/L的H2O2产生的响应计时电流后，依次加入干扰物质AsA，UA各1 mmol/L，在该应用电压下，这些电活性物质几乎没有产生干扰电流，稍后再次加入H2O2就又产生电流信号，实验表明该修饰电极制备的传感器具备很好的抗干扰能力。

3 结语

利用银纳米粒子催化H2O2还原的还原能力，以及聚多巴胺球比表面大的特性，制备出基于Ag@pdop新型H2O2无酶传感器，具有很宽的检测线性范围，较高的灵敏度，并且可以很好地避免多种物质的干扰。该修饰电极的应用条件较简单，实现了对过氧化氢良好的快速选择性检测。这方面的工作可以为开发多种新型无酶传感器的研究提供很好的方法和思路。

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Preparation of Non-enzymatic H2O2Biosensor Based on Polydopamine Spheres Supported Ag Nanoparticles

XU Shudong, LI Weidong

(Dept.ofControlandPreventionofEndemic&ParasiticDiseases,AnhuiProvincialCenterforDiseasesControlandPrevention，Hefei,Anhui230601,China)

Poly dopamine spheres supported nano-composite materials have gained more and more attentions in recent years. The functional groups of the poly dopamine spheres, such as —OH, —NH2, etc., ensure that they can be the active carriers of a variety of nano-composite materials. Taking advantage of the good reduction preparation of poly (dopamine) as well as easy loading of silver nanoparticles on the surface of poly dopamine balls, a novel Ag nanoparticles-poly dopamine spheres (abbreviated Ag@pdop) composite was synthesized.The modified Au electrode and Ag nanoparticles both have good catalytic properties to hydrogen peroxide (H2O2) reduction reaction. Based on above characteristic of the Au electrode and Ag nanoparticles, a composite electrode were prepared which can be used as a non-enzymatic biosensor of H2O2.The detection sensitivity was 14.7 μA/(mmol·L-1).The detection limit was 11.8 μmol/L, and the linear ranges were 0.2-6.0 mmol/L. The test results and anti-interference abilities are satisfactory.

poly dopamine spheres; Ag nanoparticles; non-enzymatic biosensor; hydrogen peroxide

10.3969/j.issn.2095-1035.2016.04.020

2016-04-22

2016-05-23

徐署东，男，主管检验师，主要从事理化检验研究。E-mail：xushud@126.com

O657.1；TH832

A

2095-1035(2016)04-0079-05