分子亲缘地理学及遗传标记技术的应用

赵群

（皖西学院生物与制药工程学院 安徽芜湖 241000）

分子亲缘地理学及遗传标记技术的应用

赵群

（皖西学院生物与制药工程学院 安徽芜湖 241000）

本文论述了分子亲缘地理学的产生和发展过程，以及国内外的研究进展，同时对遗传标记特别是线粒体DNA分子标记技术进行了详细阐述。

分子亲缘地理学 遗传标记技术 线粒体DNA

1 引言

1908年和1909年,英国数学家哈迪（Hardy）和德国医学家温伯格（Weinberg）分别提出在一个随机交配的种群中,若不发生突变、迁移等因素,在经过传代后初始基因或基因型频率则始终恒定不变。在群体遗传学研究的初期,由于研究手段的限制,人们没有办法探测长期进化后群体的遗传变化。随着分子生物学实验技术应用于群体遗传学,可以利用大分子序列,比如DNA 序列变异来进行群体遗传学研究。

2 分子亲缘地理学研究

2.1 亲缘地理学

亲缘地理学,又称为系统发育生物地理学,是研究亲缘关系相近的物种及种内不同种群形成现有地理分布格局的历史原因和演化过程的一门学科。亲缘地理学是生物地理学的一个分支,在解释现有种群分布状况的基础上,进一步研究种群分布的原因,追溯其进化历程,分析种群在时空上的发展变化,重建生物区系的历史。它主要偏重于对近缘物种或种内的研究,在种内水平上描述种群的系统地理格局,进而追溯其形成原因,对物种扩散和迁移等微进化历史等进行了有效的推测。

2.2 分子亲缘地理学

由于分子生物学实验技术及种群遗传学等方法和原理的运用,使亲缘地理学可以进一步从分子水平上描述种群地理格局的形成过程,探讨种群分化的历史,进而推测种群现有分布格局形成的原因。分子亲缘地理学是通过分子生物学技术在分子水平上,研究种群内部地理格局形成的相关原因。

3 遗传标记技术

3.1 遗传标记技术的发展

在分子亲缘地理学的研究的过程中,离不开遗传标记。遗传标记是指所应用的区别不同个体或种群,并且能稳定地遗传的标记物。伴随生物学实验技术不断发展与完善,遗传标记的应用与研究也越来越成熟,在发展过程中,依次出现4种主要类型的遗传标记,它们分别是形态学标记、细胞学标记、生物化学标记和DNA分子标记。

3.2 遗传标记的类型

3.2.1 形态学标记

形态学标记是指在基因表型中可进行识别与目的性状紧密相关的等位基因突变体。其主要包括质量性状和数量性状,简单而直观,目前仍然是研究很多物种的分类和起源分化关系的基础。但形态学标记的数量很少,变异较小,如孟德尔在研究分离规律时所用的性状只有两种变异类型,不能随机代表生物体的遗传组成,且生物的表型特征是遗传和环境相互作用的结果,不能直接反映真实的遗传变异情况,所以形态学标记并不完善。

3.2.2 细胞学标记

染色体组型的分析对于遗传多样性的研究具有重要意义。通过对各个分裂期的染色体数目和一系列形态学参数研究,根据染色体特征分析可获取相应的染色体组型。但由于染色体组行的差异型,可以用染色体组型作为形态学标记来研究生物的遗传多样性。

3.2.3 生物化学标记

在凝胶电泳技术产生和发展的过程中,生物化学遗传标记技术也迅速发展起来,通过生物化学标记,把对遗传多样性的研究从宏观深入到分子水平,并广泛用于种群遗传、杂交育种等各方面的研究。其中的同工酶电泳技术可以比较不同物种间基因表达产物的异同,并以此提示基因序列和功能差异。

3.2.4 DNA分子标记

随着分子生物学和分子克隆技术的完善和发展,可以利用生物DNA编码区及非编码区作为遗传标记,这种遗传标记称为DNA分子标记。DNA分子标记是DNA水平上遗传变异的直接反应,其本质是反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。在DNA分子中,由于碱基的缺失、插入、易位、倒位、重排或存在长短和排列不同的重复序列等而产生多态性,通过不同的分子标记就可以检测出这些多态性。

3.2.4.1 以分子杂交技术和电泳技术为核心的分子标记

（1）限制性片段长度多态性

主要是利用限制性内切酶对DNA进行处理切割,经酶切后DNA会形成特定大小的DNA片段,根据不同生物个体所产生的DNA片段的大小差异而构成其多态性。对于小分子DNA,如线粒体基因,可将其DNA样品经适当的限制性内切酶处理后形成不同长度的片段,然后把处理后的产物进行琼脂糖凝胶电泳分离,由于电泳迁移率不同便会在凝胶上形成连续的谱带,不同植物个体来源的DNA 可形成不同的谱带,从而表现出多态性。

（2）DNA指纹识别技术

是一种在单一实验中可以检测出大量DNA位点差异性的分子标记技术。在研究人的基因组文库时,发现了一个DNA序列高变区,这类高变区在真核生物基因组中普遍存在,被称为小卫星。小卫星序列的结构是由一较短的重复单位首尾相接、多次重复而成。由核心序列串联重复构成的小卫星DNA 探针,可以同时与众多的基因组的酶切DNA片段进行Southern杂交,得到含有多条图带的具有个体特异性的DNA杂交图谱。

3.2.4.2 以电泳技术和PCR技术为核心的分子标记

（1）随机扩增多态性

随机引物扩增建立在PCR基础上的寻找多态性DNA片段的分子标记技术。它利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸为引物,对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。

（2）扩增片段长度多态性

是由Vos发明的一种DNA分子标记技术,是一种选择性地扩增限制性片段的方法,结合了RFLP的稳定性和RAPD的灵敏性。在进行AFLP实验时,先用核酸内切酶酶解基因DNA,再将接头接到限制性片段的两端,形成带有接头的特异性片段,然后用专用引物扩增这个特异性的片段。

（3）微卫星DNA标记

进行微卫星分子标记时,首先要构建基因组文库,根据要得到的微卫星的序列类型,设计合成寡核苷酸探针,微卫星序列的获取主要通过重组克隆菌落原位杂交以及鉴定阳性克隆；后通过鉴别微卫星序列的转移性而合成相关的细胞引物,以待分析的核DNA为模板进行PCR；最后对扩增后的产物进行检测,可通过放射自显影和银染法来检测扩增产物。

（4）简单序列重复区间

是近年来在物种的遗传多样性与遗传结构、物种形成和种质鉴定等研究领域广泛应用的分子标记技术,该技术直接对其基因组进行多态性分析,没有种属限制,不需要DNA 探针,不受环境和生长发育阶段的影响,不存在表达与否的问题,具有简便快速、准确、多态性高、稳定性好等特点。

（5）单核苷酸多态性

单核苷酸的多态性实在基因组DNA研究的基础上,分析特定核苷酸诱发DNA序列变异的多态性,其中核苷酸转换、颠倒、插入或缺失是常见的DNA序列变异,其中至少有一种等位基因在群体中的突变频率不小于1%。SNP只有两种类型,即双等位基因。所以,在对已知突变位点检测时只需对SNP进行两种不同类型碱基的确认分析即可,不必对DNA片段进行全序列测定,有利于发展自动化检测。SNP具有在个体中的多态信息量比SSR标记的多、分布广和稳定遗传等特点。

3.2.4.3 以DNA直接测序技术为核心的分子标记

就是直接检测基因组DNA的核苷酸排列顺序,因此可以直观地反映遗传的本质。DNA序列分析一般只适用于对较小的DNA片段或基因进行比较分析。可利用PCR技术先直接从总的DNA中扩增出大量的目的DNA片段或目的基因,再对其进行测序,进而分析其遗传多样性。

3.3 线粒体DNA

线粒体是真核细胞内为细胞活动提供能量的重要细胞器,是正常生理状态下细胞内氧化磷酸化的重要场所。线粒体DNA作为细胞内核外唯一存在的遗传物质,与核DNA相比,具有分子量小、结构简单、母系遗传、进化速度快、无组织特异性等特点,是一个相对独立的复制单位。线粒体基因组是研究DNA结构与复制的比较好的模型,也是研究真核细胞蛋白质合成合适的模型系统。

3.3.1 动物线粒体DNA概述

3.3.1.1 动物线粒体DNA的结构特征

动物线粒体DNA是共价闭合的环状双链超螺旋分子,外圈是它的重链（H）,内圈为轻链（L）。

3.3.1.2动物线粒体DNA的遗传特点

（1）无组织特异性（2）母系遗传（3）进化速度快

3.3.2 动物线粒体DNA的多态性研究

线粒体DNA的多态性是指不同群体间或群体内,线粒体DNA表现出的位点变异和序列长度变异。不同种、群间,群体内以及个体内, 线粒体DNA的一级结构都不完全相同,其存在种间及种内多态性,线粒体DNA的这个特性已被广泛地运用。

3.3.2.1 动物线粒体DNA多态性的研究方法

3.3.2.1.1 测序法

是一种无需提取线粒体DNA的检测手段,按常规方法提取基因组DNA,设计引物对目的DNA片断扩增、纯化,进行序列测定,比较不同物种或个体间的相关序列,以探求它们之间的进化关系,这种方法可获得大量直接、可靠的数据,但受技术条件和经费限制,不适合大群体和大样本的遗传和进化研究。

3.3.2.1.2 限制性长度多态性分析法

指利用限制性内切酶图谱进行序列的间接比较的方法。它检测的是线粒体DNA的随机序列,其优点是快速、经济,具有一定的精确度,尤其适用于大群体、大样本的遗传进化研究。另外,PCR技术的应用可大大减少样品的用量线粒体DNA。线粒体DNA多态分析获得的数据经处理都可转换成序列分歧度或遗传距离,便于进行结果分析。这也是线粒体DNA多态性研究中使用最多的方法。

3.3.2.2动物线粒体DNA多态性研究领域3.3.2.2.1动物线粒体DNA的种间多态性

研究表明线粒体DNA的限制性图谱具有一定的种族特征。动物研究中牛与猪的线粒体DNA经限制酶消化,可分别产生3个或2个限制性片段,而牛、山羊和绵羊均属于洞角科动物,但目前动物研究显示5种限制性酶之间几乎没有相同的限制性图谱,并且在各种酶切割位点数相同的情况下,限制性片段也存在较大的差异。

3.3.2.2.2动物线粒体DNA的种内多态性

目前在海洋生物、爬行类动物以及两栖类动物中已发现线粒体DNA具有多态性,并且在长度上易发生明显的突变如六线鞭尾晰中一个种群的线粒体DNA比另一个种群的长1200个碱基对,弓鳍鱼的线粒体DNA大小差异在16000-16900个碱基对之间。

3.3.2.2.3个体内线粒体DNA的多态性

有关研究表明动物单体缺乏线粒体DNA的杂合性,并且单一个体器官组织均可获取相同的限制性图谱。虽然偶然状态下可检出线粒体DNA杂合性,但这与杂合的细胞质以及不同组织线粒体DNA的突变密切相关,这类线粒体DNA多态性的研究在动物实验以及人体研究已证实。

［1］Poulakakis，N.，Lymberakis，P.，Tsigenopoulos，C.S.，et al.Phylogenetic relationships and evolutionary history of snake-eyed skink Ablepharus kitaibelii （Sauria：Scincidae）［J］.Molecular Phylogenetics and Evolution， 2005， 34： 245-256.

［2］Wan，L.-X.，Sun， S.-H.，Ji，Y.-T.et al.Molecular phylogegraphy of the Chinese lacertids of the genus Eremias（lacertidae） based on 16S rRNA mitochondrial DNA sequences［J］. Amphibia-Reptilia，2007，28：33-41.

［3］Zhou，Y.-Q.Application of DNA Molecular Markers Technique to Plant Research［M］.Beijing： Chemical Industry Press，2005.

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A

1674-2060（2016）03-0297-02

安徽省高校省级自然科学研究项目（KJ2013B329）